• 长期使用质子泵抑制剂 （PPI） 可能与特定的医疗条件和微生物群组成的改变有关。然而，药物、疾病和微生物群之间的相互作用之间的明确因果关系尚未完全了解。
• 组胺 2 受体拮抗剂 （H2RAs） 通常被认为是 PPI 的更安全替代品;然而，探索 H2RAs 的肠道特征及其与 PPI 的肠道特征的比较的研究有限。
• 与 H2RA 相比，PPI 对破坏肠道微生物群的影响更大，通过诱导更高程度的口到肠道传递并促进肠道中某些口腔物种的生长。
• 重要的是，PPI 显着增加了肠道中已知疾病相关物种的患病率和丰度，包括有核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)和链球菌anginosus(Streptococcus anginosus)
• 我们的研究深入了解了与 H2RA 相比，与长期使用 PPI 相关的某些疾病风险较高的机制。这些知识可以帮助医疗保健从业者在开出这些药物时做出更明智的决定，以改善患者的健康状况，尤其是长期使用

ABSTRACT

Objective: 我们旨在通过纵向分析比较质子泵抑制剂 （PPI） 和组胺 2 受体拮抗剂 （H2RAs） 对肠道菌群的影响。
Design: 健康志愿者被随机分配每天接受 PPI （n=23） 或 H2RA （n=26），连续 7 天。我们收集了干预前后的口腔（唾液）和粪便样本，用于宏基因组下一代测序。我们分析了干预诱导的口腔和肠道微生物组的改变，包括微生物丰度和生长速率、口腔到肠道的传递，并比较了 PPI 和 H2RA 组之间的差异。
Results: 两种干预措施都破坏了肠道微生物群，PPI 表现出更明显的效果。PPI 的使用导致口腔到肠道传播的程度显着增加，并促进了肠道中特定口腔微生物的生长。这导致肠道中存在的口腔物种的数量和总丰度显着增加，包括鉴定已知的疾病相关物种，如核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)和链球菌anginosus(Streptococcus anginosus)。总体而言，基于肠道微生物组的机器学习分类器可以准确区分 PPI 和非 PPI 用户，受试者工作特征曲线下面积 （AUROC） 为 0.924，而 H2RA 与非 H2RA 用户的 AUROC 为 0.509。
Conclusion: 我们的研究提供了证据表明，PPI 对肠道微生物组和口腔肠道传播的影响比 H2RA 更大，阐明了与长期使用 PPI 相关的某些疾病风险较高的机制。

INTRODUCTION

胃酸抑制剂，如质子泵抑制剂 （PPI） 和组胺-2 受体拮抗剂 （H2RA），在治疗世界各地的各种胃肠道疾病（包括消化不良、消化性溃疡和 GORD）中起着关键作用。它们是癌症、肝病或其他严重疾病患者的常用处方药，因为它们有助于缓解因治疗或与这些疾病相关的并发症而可能引起的胃部不适。虽然这两类药物都已被证明对治疗酸相关疾病有效，但长期使用 PPI 与结直肠癌 （CRC） 和 IBD 等肠道疾病以及肺炎和艰难梭菌感染等肠道感染的风险或进展相比，存在显着趋势。另一方面，H2RA 被广泛认为是一种更安全的替代品。

最近，研究人员担心长期使用 PPI 会导致肠道微生物组发生变化，其特征是各种微生物物种的丰度和多样性发生变化。肠道微生物组组成的破坏有可能增加疾病风险或进一步加剧现有的健康状况。一项基于 16S rRNA 基因测序的研究从荷兰进行了三个独立队列，以调查 PPI 使用对肠道微生物组的影响，从而发现 PPI 的使用与细菌丰富度降低有关，肠道中 20% 的已鉴定细菌显示出显着偏差，包括肠球菌属、链球菌属、葡萄球菌属和潜在致病菌属大肠杆菌。这些发现与已知的使个体易患艰难梭菌感染的变化一致，并可能解释 PPI 使用者肠道感染风险增加的原因。此外，两项采用鸟枪法宏基因组分析的大型队列研究证明了 PPI 对肠道微生物组的影响。然而，在两项研究之间，只有乳酸菌属和链球菌属两个属的 PPI 使用者表现出一致的增长趋势。需要注意的是，这些研究中的大多数是横断面的，研究人群通常由患有基础疾病和多药治疗的个体组成。这引入了许多混杂因素，这些因素可能会使分析复杂化，尽管其中许多研究采用特殊的单变量或多变量分析来减轻影响。然而，鉴于这些复杂性，区分药物的真实微生物组特征仍然具有挑战性。此外，调查 H2RAs 的微生物组特征及其与 PPI 的微生物组特征的比较的研究有限。为了解决这些问题，我们进行了一项涉及 49 名健康参与者的纵向研究，以比较 PPI 和 H2RA 引起的微生物组改变。了解这些药物对人类微生物组的影响至关重要，因为它可以导致更深入地了解胃酸抑制剂与人类微生物群之间错综复杂的相互作用，以及它与各种疾病风险增加的相关性。这些见解将通过优化治疗策略，确保患者获得最佳的医疗结果和整体健康状况，为临床实践和健康管理提供有价值的指导。

RESULTS

PPI 对肠道微生物组的破坏明显大于 H2RA

我们最初评估了 PPI 和 H2RA 组之间所有生活方式指数和参与者元数据的变化，没有发现任何统计学上的显着差异（在线补充表 2）。因此，我们直接检查了药物给药对肠道微生物组的影响。在两种药物给药后，共观察到 23 种物种（标志物）在肠道中表现出显着富集，其中许多物种在药物干预后肠道样本中的患病率也有所增加（图 1B）。此外，23 个标志物中有 16 个（~70%）通常存在于口腔微生物组中，如扩展的人类口腔微生物组数据库（eHOMD;图 1B）所示。

在这些标志物中，PPI 和 H2RA 分别诱导了 20 种和 7 种，其中两种药物共有 4 种。共享的标志物都属于链球菌属（Streptococcus genus）（唾液链球菌、副血链球菌、血链球菌 A12、口腔链球菌），它是正常口腔微生物群的一部分。此外，除副血红葡萄球菌外（S. parasanguinis），所有四个标志物在 PPI 组中的效应量 （Cohen's d） 均显著高于 H2RA 组（在线补充表 8）。此外，我们观察到两种药物诱导的肠道中口腔细菌的总丰度显着增加（图 1C;在线补充表 5）。然而，PPI 组（中位数为 ~5.29%;p=1.67e-09）的增加显著高于 H2RA 组（0.39%;p=0.13;图 1C）。

为了进一步量化两种药物引起的肠道微生物组改变的程度，我们为每个组构建了一个 RandomForest 分类器，以对给药前后收集的样本进行分类。我们使用所有微生物丰度而不是特征选择选择的特征作为输入来训练模型，以最大限度地保留数据中的信息，并避免可能遗漏可能没有单独意义但在与其他特征结合中发挥重要作用的重要特征。在我们的分析中，PPI 组在五次 3 次重复交叉验证期间，受试者工作特征曲线下面积 （AUROC） 表现出 0.924 的出色准确性，表明分类器具有很高的区分能力（图 1D）。相比之下，H2RA 组显示 AUROC 低得多，为 0.509，这表明 H2RA 治疗诱导的肠道微生物组改变不足以准确区分干预前后收集的样本（图 1E）。

此外，我们根据每个分类器中位数的相对特征权重确定了前 20 个最重要的特征。值得注意的是，在 PPI 模型中，19 个主要特征与上面确定的 PPI 标志物重叠，这意味着这些标志物种类在区分 PPI 前和 PPI 后干预样本方面起着至关重要的作用（图 1F）。然而，在 H2RA 分类器中，只观察到 6 个主要特征与 H2RA 标记重叠。此外，H2RA 主要特征的丰度倍数变化比 PPI 组低两个数量级（图 1G;在线补充表 9）。这些发现表明，H2RA 治疗引起的肠道微生物组扰动相对较小，导致 H2RA 分类器在区分 H2RA 前和 H2RA 后干预样本方面的鉴别能力降低。总之，我们的研究结果表明，与 H2RA 相比，PPI 对破坏整体肠道微生物群的影响明显更高。

PPI 和 H2RA 诱导的健康志愿者肠道微生物群的改变

• （A） 说明质子泵抑制剂 （PPI;n=23） 和组胺-2 受体拮抗剂 （H2RA;n=26） 组的干预和样本采集程序的研究流程图。
• （B） 热图显示了 PPI 和 H2RA 干预前后显着改变的肠道微生物分类群（即属和种）的效应大小（由 Cohen 的 d 测量）。红色图块表示药物增加的分类群，而绿色图块表示药物减少的分类群。紫色图块表示根据扩展的人类口腔微生物组数据库 （eHOMD） 的口腔分类群。相邻的条形图显示了相应组中显著改变的分类群的总数。下面的散点图说明了上述分类群的流行率变化。红色星号突出显示了以前与结直肠癌相关的物种。
• （C） 比较 PPI 组和 H2RA 组在基线和干预后肠道中口腔细菌累积丰度的箱形图。“口腔细菌”被定义为存在于 ≥10% 的唾液样本中的细菌（参见“方法”部分）。采用 Wilcoxon 秩和检验比较组间连续变量。
• （D） 机器学习分类器区分 PPI 干预前后肠道微生物特征的性能。受试者工作特征下面积 （AUROC） 曲线用于测量 5 倍 3 次重复交叉验证中的表现。
• （E） H2RA 分类器的性能。

PPI 和 H2RA 对口腔微生物组的干扰很小

药物诱导的肠道微生物组改变是否部分归因于口腔微生物组的改变仍有待确定。因此，我们研究了药物给药对口腔微生物组的影响。值得注意的是，PPI 干预没有显着改变任何口腔分类群（物种和更高的分类等级;在线补充图 3A）的丰度。此外，在肠道中无法检测到四种富含 H2RA 的口腔物种（在线补充图 3A）。这些结果表明，药物诱导的口腔微生物组改变不是药物诱导的肠道微生物组变化的来源。这促使我们在后续分析中探索口腔到肠道的传播。

PPI 诱导的经口到肠道传播明显高于 H2RA

为了量化药物干预前后的口腔到肠道传递，我们采用了 VallesColomer 等人推荐的管道，并使用 StrainPhlAn 4 在本研究中由 MetaPhlAn 4 鉴定的 582 个物种中鉴定了菌株水平的潜在可传播物种（参见方法部分;在线补充表 6）。在基线时，我们总共确定了 21 种传播物种，其中 17 种 （80.95%） 在身体的两个部位都流行（即，基线时口腔和粪便物种的患病率均为 >10%;图 2A;在线补充表 10），表明健康参与者经常经口传播肠道。两个药物组之间基线样品中传播物种的数量和总丰度均无显著差异（p>0.05;在线补充图 4A 和表 11）。

使用 PPI 后，我们观察到与基线相比，可传播物种的数量（中位数为 9）显着增加（图 2A;p=1.02e-04;配对样本的 Wilcoxon 秩和检验）。此外，使用 PPI 后，这些物种的总体丰度也显着增加（图 2A;p=1.5e-04）。使用 H2RA 后观察到类似的模式，但与 PPI 组相比，增加的程度明显较小（在线补充图 4B）。

此外，我们比较了 PPI 组和 H2RA 组之间传播物种流行率的变化。在两组中至少一个样本显示经口到肠道传播的 42 个 SGB 中，有 37 个在使用 PPI 后患病率增加，而使用 H15RA 后只有 2 个。14 个 SGB 显示两组的传播流行率增加，但其中大多数 （12 个 SGB） 显示 PPI 组的患病率增加高于 H2RA 组（图 2B;在线补充表 12）。

同一参与者的口腔和肠道微生物组组成之间的 Bray-Curtis 差异 （BCD） 分析可以进一步支持 PPI 诱导的显着较高的口腔到肠道传递。在基线时，观察到接近 1 的 BCD，突出了口腔和肠道微生物组的不同组成（在线补充图 3B）。然而，在两次给药后，同一个体体内口腔和肠道之间的微生物组成发生了显着变化。值得注意的是，与 H2RA 组相比，PPI 组在吸毒后 BCD 的降低更明显（在线补充图 3B;配对样本的 Wilcoxon 秩和检验;PPI 组 p=4.77e-06;p=0.045 在 H2RA 组中）。

引人注目的是，我们发现 Fusobacterium nucleatum 是一种经过充分研究的 CRC 标志物，在使用 PPI 后在 ~9% 的参与者中被确定为可传播物种，但在使用 H2RA 后没有。有核镰刀菌普遍存在于口腔中，已被发现当传播到肠道时会促进炎症和免疫逃避，为肿瘤生长创造有利的环境。它还与肠道中的免疫细胞和其他细菌相互作用，促进免疫抑制环境，促进肿瘤生长和转移。

这些发现表明，与 H2RA 相比，PPI 诱导从口腔传递到肠道的物种明显更多，导致这些物种在肠道中的分布更普遍，包括已知的 CRC 相关标志物。

PPI 诱导的经口到肠道传递比 H2RA 更高，并促进肠道中传播物种的生长

• （A） 口腔、肠道或两者中的普遍物种及其在药物干预前后的口腔到肠道的传递。顶部的热图描绘了按丰度降序从左到右排序的物种的流行度（两个地点的流行物种都根据其肠道丰度排序）。使用先前研究定义的标准将物种分为四类，包括在 >10% 的粪便样本和 <10% 的唾液样本中观察到的“粪便”物种（n=295，占总数的 50.69%），仅在口腔样本中普遍存在的“口腔”物种（n=268,46.05%），以及在 >10% 的唾液和粪便样本中普遍存在的“两种”物种（n=19,3.26%）。左下角的热图显示了在 PPI 和 H2RA 组中的两个时间点检测到的所有经口肠道传播的物种。箱线图从左到右排序，比较了两组给药前后经口到肠道传播的物种的数量和总丰度。
• （B） 散点图显示了 PPI 和 H2RA 药物给药前后细菌的经口到肠道传播流行率。左侧两个面板中的绿色三角形代表基线时细菌经口到肠道的传播流行率，而红色方块代表干预后的传播流行率。右图总结了两组干预前后经口-肠传播流行率的变化。灰色标签表示 （A） 中定义的 “两种 ”物种，而紫色标签表示 （A） 中定义的 “口腔 ”物种。红星突出显示了 Fusobacterium nucleatum，根据以前的研究，这是一种经过充分研究的结直肠癌标志物。
• （C） 箱线图显示了 PPI 组中细菌生长速率显著不同的物种（通过峰谷比测量）。红色标签表示 PPI 标志物（即，与基线相比，使用 PPI 后肠道中的细菌含量明显更高）。采用 Wilcoxon 秩和检验比较组间连续变量。

PPI 促进肠道中传播物种的生长

为了评估药物使用是否可以通过促进或抑制肠道物种的生长来潜在地影响肠道物种的丰度，我们采用了一个名为 PTR 的指数来量化细菌生长动力学。具体来说，我们使用 DEMIC 工具来估计重叠群与复制起点的相对距离，从而准确评估不同样本中的细菌生长速率。尽管这种方法对测序深度的要求很高，但我们能够量化 1186 个物种中 355 个物种的生长速率（在线补充表 13）。

使用 PPI 后，共有 5 个物种表现出显着增加的生长速率 （PTR 值）。其中，三个（占总数的 60%）与富含 PPI 的标志物重叠，表明 PPI 进一步促进了肠道中传播物种的生长（图 2C）。值得注意的是，PPI 还促进了非marker物种的生长，例如嗜热链球菌和红链球菌。此外，我们观察到 PPI 的使用抑制了 Blautia obeum 的生长，这与 Maier 等人最近的一项研究一致。相比之下，H2RA 的使用并没有显着影响这些物种的生长（图 2C）。

需要注意的是，这些观察到的 PPI 使用效果可能归因于直接的药物-微生物群相互作用或微生物群内的相互作用，这需要在未来进行实验验证。

PPI 诱导的肠道微生物标志物与多种疾病的风险相关

为了获得与 PPI 诱导和 H2RA 诱导的经口到肠道传播物种相关的疾病风险，我们检索了 GMrepo V.2 数据库，37 肠道微生物组衍生的疾病标志物关系存储库（参见方法部分）。在 PPI 或 H2RA 诱导的 42 种传播物种中，有 22 种在 26 个队列中收集的疾病种群中显示出显著富集，对应于 16 种疾病，包括心血管疾病 （CVD）、克罗恩病、肝硬化、IBD、COVID-19、CRC 等（图 3;在线补充表 7）。在 22 种物种中，10 种是 PPI 诱导的，与 15 种疾病相关，而 4 种是 H2RA 诱导的，与 11 种疾病相关。值得注意的是，其中一些物种已被验证在相应疾病的发生和发展中发挥作用。例如，在我们的研究中被确定为在 8 种不同疾病中富集的 S. anginosus，以及星形链球菌（它是 42 种可传播物种之一，并且在使用 PPI 后表现出较高的传播流行率）和中间链球菌，构成了链球菌心绞痛组 （SAG）。这组细菌可导致化脓性感染和恶性肿瘤的发展。它们可以从肠道移动到其他器官，引起肝脓肿和心内膜炎等广泛感染。一些研究还发现，SAG 可能是与胃癌有关的致病菌。此外，一项涉及 8973 名参与者的横断面研究显示，心绞痛链球菌和口链球菌与冠状动脉钙化评分有很强的相关性，表明 CVD 的风险很高。该研究还确定了其他相关物种，包括 S. parasanguinis 和 Streptococcus gordonii，它们被检测为 PPI 标志物，并且与我们研究中的其他几种疾病有关。

这些结果表明，与 H2RA 相比，PPI 使用诱导的特定物种经口到肠道的传播可能导致更广泛的疾病风险。这些可传播物种与各种疾病之间已确定的关联强调了 PPI 诱导的肠道微生物组改变在塑造疾病易感性方面的潜在意义。

METHODS

Subject recruitment

最初共招募了 64 名志愿者，在根据上述标准评估问卷结果后，排除了 8 名志愿者。其余 56 名参与者被随机分为两组，以确保性别、年龄和基线状况等关键特征的平衡：PPI 组（服用奥美拉唑，一种 PPI，n=28）和 H2RA 组（服用法莫替丁，一种 H2RA，n=28）。7 名志愿者由于第一个采样点前 2 个月的暑假而退出研究，而 49 名志愿者完成了研究（PPI 组，n=23;H2RA 组，n=26）。使用计算机生成的随机数表进行随机化，并在分配干预措施之前隐藏。
.有关实验概述的更多详细信息，请参阅在线补充图 1。在线补充表 1 中描述了相关元数据。值得注意的是，PPI 干预并没有显着改变任何口腔分类群（物种和更高的分类等级;在线补充图 3A）的丰度。

PPI 组和 H2RA 组之间临床数据的差异

采用统计分析来检查所有收集的临床数据的差异 （在线补充表 2）。Wilcoxon 秩和检验用于连续变量，而 χ2 检验用于分类变量

干预程序和样本采集

所有入组参与者在第 0 天（2022 年 6 月 12 日）提供了基线唾液和粪便样本。然后，PPI 组接受为期 7 天的奥美拉唑疗程（每天 20 毫克），并在第 7 天（2022 年 6 月 19 日）提供另一组唾液和粪便样本。同样，H2RA 组接受了类似的手术，但接受了法莫替丁 （每天 20 毫克）。有关实验的整体设计，请参阅图 1A。

参与者在清晨、口腔卫生和早餐之前在家中收集唾液样本。为防止 DNA 降解，2 mL 室温稳定试剂盒与从每个参与者收集的 2 mL 唾液混合。对于粪便样本采集，参与者使用了粪便样本采集试剂盒与唾液样本采集在同一天。该试剂盒还包含 2 mL 室温稳定试剂。收集后的 12 小时内，将收集的唾液和粪便样本全部转移到 -80°C 的冰箱中，并储存至 DNA 提取。此外，重要的是要注意，这项研究是一项更大规模的随机临床试验 （RCT） 的一部分。完整的实验设计包括额外的一周，在此期间，参与者在服用益生菌的同时（从第 8 天到第 14 天）服用胃酸抑制剂。在停药后第 14 天和第 7 天 （第 21 天） 收集唾液和粪便样本。此外，还有一个对照组只服用益生菌一周。所有伦理程序均按照综合实验设计执行。有关整个设计和协议的详细信息，请参阅在线补充文件 1。

DNA 提取、文库构建和鸟枪法

使用 MagPure 粪便 DNA KF 试剂盒 B（Magen，中国）提取粪便和唾液样本中的 DNA。使用 Qubit dsDNA BR 检测试剂盒（Invitrogen，美国）测量每个样品中基因组 DNA 的浓度和纯度。为了评估 DNA 完整性，进行了 1% 琼脂糖凝胶电泳。

随后，根据制造商的说明，用 Covaris LE220（Covaris，Inc，美国）随机片段化 1 μg 基因组 DNA。通过磁珠将片段化的 DNA 筛选成平均大小为 200–500 bp。选定的片段经过末端修复、3′腺苷酸化、接头连接、PCR 扩增，产物被磁珠纯化。双链 PCR 产物使用 splint oligo 序列进行热变性和环化。将单链环 DNA 格式化为最终文库，并通过 QC 鉴定。在 BGI（中国武汉）的 MGISEQ-2000 平台上进行全基因组测序，双端读长为 150 bp （PE150）。我们分别获得了每个唾液和粪便样本的 76.4±6.0 和 38.5±270 万对原始读数 （平均值 ±SD）（在线补充表 3）