通过基因组分辨宏基因组学追踪粪便微生物群移植实验中的微生物定植

• 追踪FMT受体中供体MAG的发生和分布模式

Abstract

背景： 粪便微生物群移植 （FMT） 是治疗复发性艰难梭菌感染的有效方法，有望治疗与肠道菌群失调相关的其他疾病。然而，我们对哪些微生物种群成功地定植受体肠道缺乏足够的了解，并且广泛使用的用于研究 FMT 实验微生物生态学的方法无法提供足够的分辨率来识别可能负责 FMT 衍生益处的种群。

方法： 我们使用鸟枪法宏基因组学以及组装和分箱策略，从单个 FMT 供体的粪便样本中重建宏基因组组装基因组 （MAG）。然后，我们使用宏基因组图谱来跟踪两个 FMT 受体中供体 MAGs 的发生和分布模式。

结果： 我们的分析显示，我们从供体中鉴定的 92 个高度完整的细菌 MAGs 中有 22% 成功定植并在两个受体中保持丰度至少 8 周。大多数具有高定植率的 MAGs 属于拟杆菌目。绝大多数缺乏定植证据的属于梭菌目，定植成功与孢子形成相关的基因数量呈负相关。我们对151个公开可用的肠道宏基因组进行的分析表明，在人类微生物组计划的参与者中，那些在两位受体中都成功定植的供体MAGs（宏基因组组装基因组）较为普遍，而在两位受体中均未定植的供体MAGs则较为罕见。尽管我们的数据集显示了分类学与给定 MAG 的定植能力之间的联系，但我们还确定了属于同一分类单元且具有不同定植特性的 MAG，这强调了适当分辨率水平的重要性，以探索定植的功能基础并确定培养、假设生成和模型系统中测试的目标。

结论：我们研究中采用的分析策略可以提供对细菌种群的基因组见解，这些细菌种群可能对 FMT 的疗效至关重要，因为它们在肠道定植和代谢特性方面的成功，并指导培养工作以研究该程序超越关联的机制基础。

Results

对 10 个粪便样本的基因组 DNA 进行鸟枪法测序，共得到 269,144,211 个质量过滤的 2 × 150 个双端宏基因组读数（附加文件 2：表 S1）。通过共组装对应于 115,037,928 个质量过滤读数的供体样本，我们回收了 51,063 个长度超过 2.5 kbp 的重叠群，并将它们组织成 444 个基因组箱，在不同完成水平上总共包含 442.64 Mbp（附加文件 2：表 S1，附加文件 3：图 S1）。使用完成和大小标准，我们将 92 个基因组 bin 指定为宏基因组组装基因组 （MAG）（图 1，附加文件 2：表 S1）。MAGs 在个体之间的分布中出现了四种主要模式：同时定植受体 R01 和 R02 的 MAG （组 I， n = 20），仅定植于 R01 的 MAGs （组 II，n = 11），仅 R02 （组 III，n = 8） 和未定植于任一受体的 MAG （组 IV， n = 13） （图 1）。我们发现供体样本中 MAGs 的丰度与其定植受体的成功之间没有相关性 （方差分析，F = 0.717，p = 0.543）。附加文件 2：表 S1 报告了每组中每个 MAG 的检测和平均覆盖率统计数据。我们的受者都患有轻度/中度溃疡性结肠炎 （R01 患有直肠炎，R02 患有左侧/远端结肠炎），FMT 后肠道炎症均有所减轻。R01 在 FMT 之前的初始粪便钙卫蛋白计数为 26，在第 4 周降至 <17（第 8 周未收集数据），和 R02 的粪便钙卫蛋白计数第 4 周 （W4） 和第 8 周 （W8） 分别从 947 例 （FMT 前） 下降到 68 例和 34 例。

在两个受体中定植的 20 个 MAG 中，有 14 个的分类学解析为拟杆菌目(Bacteroidales)（图 1）。除拟杆菌属外，第 I 组还包括 5 个 MAG，它们被归类为梭菌目(Clostridiales)，1 个 MAG 被归类为冠状病毒菌目(Coriobacteriales)。CheckM 将 I 组 MAGs 分为拟杆菌属 （n = 5）、Alistipes （n = 5）、Odoribacter （n = 1）、Paraprevotella （n = 1） 和 Barnesiella （n = 1）。7 个 MAGs 未分配给该组中的特定属。与拟杆菌属为主的第 I 组相反，13 个 MAG 中没有定植受体（第 IV 组）的 10 个分解为梭状芽胞杆菌目。其余 3 个 MAG 在目级别没有分配任何分类法。第 IV 组中 MAGs 的唯一属级注释是瘤胃球菌 （n = 2）。总体而言，CheckM 没有为第 I 组和第 IV 组的 33 个 MAG 中的 18 个分配任何属级分类。仅在两个受体中的一个定植的 MAG 没有显示出一致的分类信号：虽然仅在 R01 （组 II） 定植的 11 个 MAG 中有 9 个被分配到梭状芽胞杆菌目，但仅在 R02 （组 III） 定植的 8 个 MAG 中只有 4 个被分配到该顺序（图 1，附加文件 2：表 S1）。第 III 组中剩余的 MAGs 被分配到拟杆菌目 （n = 2） 和 Burkholderiales （n = 1） 目，其中一个没有解析为任何目级分类单元 （n = 1）。我们还采用了系统发育方法来研究我们的 MAGs 分类学相对于参考基因组的有效性（附加文件 4：图 S2）。CheckM 的所有顺序级分类注释都与我们 MAGs 的系统发育位置一致。我们通过删除不同方法不同的注释解决了属级别的不一致。

我们使用人类微生物组项目肠道宏基因组来研究我们观察到的供体 MAGs 的差异定植结果是否代表它们在健康个体中的发生。我们对 151 个公开可用的肠道宏基因组的分析表明，I 组中在两个受体中定植的供体 MAG 更为普遍，而 IV 组中未定植于两个受体的 MAGs 在 HMP 的参与者中更为罕见（方差分析，F = 10.04，p < 0.001;图 1）。事实上，虽然 I 组 MAGs 发生在 40.63% （±26.67%） 的个体中，但 IV 组 MAGs 显示出更多的散发模式，因为它们仅在 10.39 （±5.69%） 的 HMP 宏基因组中被检测到（图 1，附加文件 1：表 S3，附加文件 5：图 S3）。这些结果表明，我们在这里回收的供体 MAGs 的相关性不一定局限于我们的研究，并且代表了具有高定植和低定植成功模式的种群子集。

图 1 MAG 在样本和 HMP 宏基因组中的分布

• a FMT 前 （pre-FMT）、FMT 后 4 周 （W4） 和 FMT 后 8 周 （W8） 的 92 个 MAG 及其在 4 个供体样本（4 个内圈）以及 2 个受体（R01 和 R02）中的检测水平。供体层和受体层中带有红色和蓝色的矩形表示给定样品中给定 MAG 的检测水平。最外层的两个层显示每个 MAG 的属级和目级分类。a 中的选择代表基于分布模式的四组 MAG：第 I 组有 20 个 MAGs 在两个受体中定植，第 II 组有 11 个 MAGs 仅定植 R01，第 III 组有 8 个 MAGs 仅定植 R02，最后，第 IV 组有 13 个 MAGs 在两个受体中都没有定植。
• b 两个示例 MAG 中每个重叠群的检测结果汇总为 a 中的单个检测值。
• c b 中显示的 MAG 的两个示例重叠群中每个核苷酸位置的覆盖率。
• d 151 个 HMP 肠道宏基因组中 I 组和 IV 组 MAG 的患病率，以及 HMP 肠道宏基因组中 MAG 54（I 组）和 MAG 26（IV 组）的检测，这是两个例子

Additional file 4: Figure S2

• 1758 个金标准基因组 92 个 MAGs 的系统发育分析。MAG 旁边的正方形和三角形表示系统发育分析和 CheckM 结果之间的一致性 (绿色) 和不一致性 (红色)。空白的表示我们没有在指定的级别上为给定的 MAG 分配任何分类。

然后，我们研究了 MAGs 的功能潜力与其定植成功之间是否存在联系。500 个功能和 107 个子系统的经典对应分析 （CCA）（附加文件 6：表 S2）显示，I 组 MAGs 具有较高的编码醌辅因子基因的相对丰度，以及涉及硫辛酸合成和芳香族化合物代谢的功能。相比之下，IV 组 MAGs 携带更多与休眠和孢子形成、孢子 DNA 保护、运动和趋化性相关的基因 （pseudo-F = 2.156，p < 0.0001）。有趣的是，仅转移到 R01 （第 II 组） 的 MAG 也携带了更多数量的休眠和孢子形成以及孢子 DNA 保护基因（图 2，附加文件 6：表 S2）。II 组和 IV 组 MAGs 之间的功能相似性也反映在它们在 HMP 宏基因组中的检出率上（附加文件 1：表 S3，附加文件 5：图 S3）。这表明，尽管信号强烈，但功能潜力并不是定植成功的可靠预测指标，个体对同一供体的反应可能不同。

图 2 四组 MAG 中函数的经典对应分析。显示了 39 个重要的功能子类别

我们还调查了 FMT 后受者在多大程度上变得像供体。正如预期的那样，基于供体 MAG 平均覆盖率的分析表明，FMT 后供体和受体之间的相似性增加（图 3a）。将宏基因组短读长映射到供体 MAGs 对受体微生物种群的了解有限。为了最大限度地减少任何潜在的偏差，我们还通过注释所有宏基因组短读长为供体和受体样本生成了属水平分类图谱。该策略还使我们能够将 FMT 前后的供体以及受体与 HMP 队列的更大背景进行比较（图 3b）。该分析表明，供体样本与 HMP 队列没有明显差异 （PERMANOVA，伪 F = 1.489，p = 0.110）。相比之下，两个受者的 FMT 前样本与 HMP 队列和供体样本显著不同 （PERMANOVA，pseudo-F = 4.470，p = 0.001）。然而，FMT 后的受体样本不再与 HMP 队列不同 （PERMANOVA，伪 F = 1.395，p = 0.168） （图 3b）。根据来自短宏基因组读数的分类学特征，两个受体与 FMT 后供体微生物群的相似度超过 60%。分类学特征的相似百分比分析 （SIMPER） 表明，FMT 后两个受体的相似度为 79.60%，而拟杆菌属是 FMT 前和 FMT 后 4 周受体样本之间差异的最大部分 （32.42%）。FMT 后 W4 和 W8 之间受体的分类图谱没有显着变化 （PERMANOVA，pseudo-F = 0.221，p = 0.631）。这些结果表明，我们的受者是 HMP 队列的异常值，在 FMT 后变得更像 HMP 队列。然而，一个重要的问题仍然存在：这种趋同在多大程度上是由于供体 MAG 而不是由于受体微生物种群中最初稀有成员的丰度变化？为了研究这一点，我们首先确定了在给定受体的 FMT 前宏基因组中未检测到的供体 MAG，并在 FMT 后从受体的 W4 和 W8 宏基因组中删除了短读长。然后，我们用剩余的读数表征了分类图谱（图 3c）。由于没有与供体 MAG 匹配的读数，FMT 后收集的样本的分类学谱仍然接近 FMT 前的状态，并且与供体和 HMP 宏基因组不同，表明供体群体对趋同的贡献更重要，而不是最初罕见的受体群体的出现。这对于 R01 尤其明显，其中 W8 FMT 前后的分类图谱高度不同 （R2 为 0.122），但在减去与供体 MAG 匹配的读数后变得更加相似 （R2 为 0.634）。考虑到 92 个 MAGs 只是我们最初从供体那里回收的 444 个箱的一个子集，我们测试了当所有 444 个宏基因组箱用于去除短读数时，这些趋势是否保持相似，并确认结果没有改变（附加文件 7：图 S4）。

图 3 FMT 前后供体样本和受体样本的相似性

• 非度量多维标度基于 92 个 MAG 的平均覆盖率，并基于本研究的微生物群落概况和 MetaPhlAn 注释的短读长属水平的 151 个 HMP 宏基因组。聚类采用平方根归一化值与 Bray-Curtis 相似性指数的平均关联。标签代表 FMT 前 （pre-FMT）、FMT 后 4 周 （W4） 和 8 周 （W8） 的接受者 （R01、R02）。灰色圆圈代表 HMP 宏基因组。
• 面板 a 根据供体 MAG 的覆盖率值显示 FMT 后受体微生物群落谱的变化。
• 面板 b 显示基于每个样品中所有短宏基因组读数的属级分类的样品组织。
• 相比之下，图 c 仅显示与供体 MAG 不匹配的短宏基因组读段的属级分类法，该分类法基于样本的属级分类法

Additional file 7: Figure S4

• 基于 4 个供体，6 个受体和 151 个 HMP 宏基因组的微生物属级分类的非公制多维标度，在从受体宏基因组中去除与供体仓匹配的短读数之后。