精确鉴定肠道菌群中多样的血液病原体

关键词

• 造血细胞移植：hematopoietic cell transplantation（HCT）
• 血液感染：bloodstream infections（BSIs）

概述

对于每位血液感染患者的全面评估包括试图确定感染源。病原体可能来自不同的地方，如肠道菌群、皮肤和外部环境。确定感染的确切来源将使得可以精确地针对源头进行干预管理。很不幸，医院感染控制实践往往基于对各种特定病原体来源的假设；如果这些假设是错误的，就会导致无法减少病原体暴露的干预措施。

在这项研究中，我们开发并应用了一种简化的生物信息学工具，名为StrainSifter，来精确地将血液病原体与候选源进行匹配。然后，我们利用这种方法来调查造血细胞移植受者队列中的肠道菌群，作为潜在的血液病原体库。

我们发现患有大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）血液感染的患者同时在肠道携带这些细菌，这表明肠道可能是这些感染的来源。

我们还发现了一些情况，通常不属于肠道的病原体，比如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），存在于肠道菌群中，从而对这些感染通常源自环境或皮肤的现有非正式学说提出了质疑。

因此，我们提出了一种区分不同血液感染来源的方法，这可能有助于更准确地追踪和预防医院获得性感染。

介绍

感染的临床管理涉及评估和消除感染源。流行病学上，血液感染（BSIs）在住院患者中很常见，并且对患者的发病率和死亡率有着重大贡献。因此，在临床护理和医院流行病学中，识别血液感染源至关重要。血液感染在免疫功能受损、住院时间较长的患者中尤为常见，例如造血细胞移植（HCT）受者。由肠道菌群中的肠道病原体引起的原发性血液感染通常是由于微生物从受损的肠道屏障穿越到血液中引起的。相反，非肠道共生菌和环境细菌可以通过静脉输液管路和皮肤上表皮完整性受损的部位进入血液循环。目前用于识别造血细胞移植患者血液感染源的方法包括脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型（MLST）。尽管这些方法快速、经济且在许多生物体中标准化，但不太理想用于区分细菌菌株。然而，微生物的致病性和传播在某种程度上取决于菌株水平的变异性，因为同一物种的不同菌株在引起疾病的能力上可能存在很大差异。全基因组测序（WGS）有助于探索菌株水平的毒力决定因素，并能够精确追踪病原体。

尽管对菌株基因组的比较主要是通过细菌分离株进行的，但较新的计算工具（如metaSNV、MIDAS和StrainPhlAn）可以在宏基因组之间分析菌株变异。这些精细的菌株水平分析使我们能够了解细菌何时以及如何传播，以及它们如何随时间变化。然而，尚未开发生物信息学工具来通过将致病菌分离株与复杂的微生物组样本（例如人类粪便）进行比较，以识别感染的具体来源。在这项工作中，我们介绍了一种名为StrainSifter的生物信息学流程，用于将病原体与潜在来源进行匹配。然后，我们将这个工具应用于比较造血细胞移植患者肠道和血液中的细菌菌株，旨在更好地了解这一人群中血液感染的来源。

我们在美国加利福尼亚州斯坦福大学医院对自体和异体造血细胞移植受者进行了一项回顾性队列研究。我们在2015年10月5日至2017年6月9日期间，对所有同意进行组织生物库协议的受试者进行了每周一次的粪便采样。如果在血液感染发作前的30天内采集到了粪便样本，并且符合标准血液感染（BSI）标准的血液分离株也被保存下来，我们将纳入这些患者进行研究。队列的临床特征列在表1中（个体患者数据显示在补充表1中）；在血液感染前30天内确定使用的选择性抗生素和全静脉营养。

我们对每位患者进行了中位数为两个（范围：1-8）的粪便样本进行测序，这些样本在血液感染前中位数为9天（范围：-58至+31天）进行采集 (Supplementary Fig. 1; read counts in Supplementary Tables 2 and 3)。粪便序列数据通过使用One Codex平台进行了分类学分类。我们观察到在肠道中以≥0.1%相对丰度存在的血液感染物种中，有32个中的15个（47%）是独特的。其中有10个预期是肠道来源的（其中8个通常是肠道来源，2个通常是口腔来源）。有一位患者出现了两个物种的血液感染，这两个物种在粪便中均超过了阈值水平(Supplementary Table 4; full taxonomic classifications in Supplementary Table 5)。

Fig. 1 在BSI之前，肠道菌群中存在不同相对丰度的BSI病原体

a-d，微生物读数在物种级别进行分类后的相对丰度。图中显示出相对丰度大于等于1.5%的物种，并且堆叠的柱状图不一定总和为100%。在柱状图和每个面板的关键部分中，用黑色标出了引起BSI的病原体。BSI和植入相对于HCT的时间情况可在补充表1中找到。在细菌血症之前，大肠杆菌（a）和肠球菌（b）占据主导地位。克雷伯菌（c）和表皮葡萄球菌（d）在BSI之前以相对较低的丰度存在于肠道菌群中。

接下来，我们调查了在感染前肠道中是否存在更高相对丰度的血液感染物种，就像之前报道的那样。在15个血液感染中，我们观察到在其中两个病例中，肠道中的病原体在相对丰度上占据主导地位(Fig. 1)。在这两种情况下，预计BSI病原体是肠道起源的(E. coli from patient 3; Enterococcus faecium from patient 25)(Fig. 1 and Supplementary Table 4)。相比之下，其他肠道细菌相对丰度较低（患者2的克雷伯菌K. pneumoniae和尾孢肠杆菌相Enterobacter cloacae对丰度分别为2.8%和0.6%）(Fig. 1 and Supplementary Table 4)。所有通常非肠道的微生物相对丰度较低（0.01-2%；患者19的铜绿假单胞菌，患者13的表皮葡萄球菌），或在BSI之前未在肠道中检测到（多个患者的金黄色葡萄球菌）(Fig. 1 and Supplementary Table 4)。在几位患者的粪便样本中，我们观察到一些候选病原体的相对丰度很高，但这些病原体并未引起这些个体的BSI。具体而言，患者14经历了克雷伯菌引起的BSI，然而在两个时间点的粪便样本中，其他潜在病原体占据主导地位：在BSI发生前9天，大肠杆菌的相对丰度为64%；在BSI发生后19天，肠球菌的相对丰度为82%(Supplementary Table 5)。

Supplementary Figure 2. StrainSifter workflow

流程图展示了StrainSifter流水线的输入、分析步骤和输出。

来自同一患者的肠道和血液感染（BSI）菌株之间的关系比来自不同患者的菌株更为密切

通过StrainSifter评估的细菌菌株之间的系统发育关系。分支末端的颜色表示粪便（棕色）和血液感染（红色）样本。来自同一患者的样本在系统发育上彼此之间更密切相关（蓝色突出显示），而不同患者的样本之间关系较远。给出的天数是相对于BSI的。未显示了铜绿假单胞菌和尾孢肠杆菌的系统发育树，因为这些物种在多个肠道宏基因组中没有足够丰度的观察。值得注意的是，尽管患者20的BSI被归类为表皮葡萄球菌，但该菌株不满足包含在表皮葡萄球菌系统发育树中的覆盖要求。

尽管分类学一致性表明血液感染病原体存在于肠道微生物群中，但我们希望以更高的精确度测试这个假设。为了实现这一点，我们开发了StrainSifter（补充图2），这是一个生物信息学流程，可以检测短读数据集中是否存在足够丰度的病原体，并输出样本之间的系统发育树和单核苷酸变异（SNV）计数。我们使用StrainSifter来研究我们的宏基因组和分离菌株中每种BSI病原体菌株的相关性。利用短读基因组组装工具将分离菌株的读取组装成初步基因组（组装统计数据见补充表6，CheckM评估结果见补充表7）。我们使用StrainSifter将我们样本集中的所有BSI和粪便菌株之间的系统发育关系进行比较（Fig. 2），并与公开可用的数据进行比较（upplementary Fig. 3），并使用StrainSifter计算SNV数目（补充表8和9）。值得注意的是，在我们的研究中，包括的30名患者在粪便样本中都没有足够丰度的S. aureus（金黄色葡萄球菌）以进行StrainSifter的分析，这表明该菌株可能很少在HCT患者的肠道中定植。

总体而言，我们发现来自同一患者的血液感染和肠道宏基因组菌株之间的关系比来自不相关患者的菌株更为密切相关。正如预期的那样，通常属于肠道菌种的血液感染和肠道菌株，如E. coli（大肠杆菌）（患者3和7）、E. faecium（肠球菌）（患者25）、K. pneumoniae（克雷伯菌）（患者2）和Streptococcus mitis（口腔链球菌）（患者22），在系统发育上密切相关（Fig. 2），这支持了长期以来这些病原体是源自肠道的学说。在一个极端情况下，在患者3的BSI和粪便菌株中，我们观察到在BSI发生前33、32和27天的时间点之间没有发现任何SNV，这表明在感染发生前一个月以上，相同的大肠杆菌菌株存在于肠道中（Supplementary Table 9）。在另一个极端情况下，我们在患者7的大肠杆菌血液感染（BSI）和粪便样本之间测得了259个SNV。这一令人惊讶的观察结果表明存在一种密切相关菌株的群体，其中主导菌株随时间变化。另一种可能是导致血液感染的大肠杆菌菌株可能是在其他地方获得的。

出乎意料的是，我们观察到在来自同一患者的样本中，对于通常非肠道菌种，如S. epidermidis（表皮葡萄球菌）（患者13）和铜绿假单胞菌（患者19，未显示），肠道和血液感染菌株之间关系密切相关（Fig. 2）。我们在患者13的血液感染（BSI）和肠道S. epidermidis（表皮葡萄球菌）菌株之间发现了一个SNV（每百万碱基对0.4个SNV），这表明血液菌株与在感染发生前1天在肠道中发现的菌株高度一致（Supplementary Table 9）。此外，我们观察到在血液和粪便样本中的相同P. aeruginosa(铜绿假单胞菌)菌株之间没有区分性SNV。虽然铜绿假单胞菌可以存在于肠道微生物群中，但表皮葡萄球菌通常被认为起源于皮肤。进一步有证据表明，尽管保留了line，但患者13的血液培养在2天内消除，这表明表皮葡萄球菌菌血症与line并没有明显的相关性（补充表1）。有趣的是，尽管在连续的两个时间点上（>60%）表皮葡萄球菌相对丰度很高（补充表5），但患者7没有出现表皮葡萄球菌的血液感染。最后，为了比较基于全基因组测序的方法与传统菌株分型方法，我们进行了体外MLST分析（补充表10）。在四个同时对肠道和血液感染菌株进行了MLST分型的情况下，结果与StrainSifter一致。

对于肠道微生物群成为致病菌的贡献来源，这些微生物必须是活着的。然而，使用StrainSifter无法确定这些微生物是否存活。衡量生物体存活的替代方法是DNA复制的速率。我们使用一种可用的生物信息学工具（27）来评估来自9名患者的11个粪便样本的复制速率，在这些样本中，肠道和血液感染菌株是一致的，并发现所有样本的复制速率都表明存在活跃的复制过程（补充表11）。

尽管在为期20个月的研究期间存在重叠的住院情况，但根据血液分离菌株的序列相关性或在肠道微生物群库中测量的潜在病原菌的序列相关性，我们观察到个体之间潜在病原体传播事件相对较少。例如，患者12和患者14的粪便样本中检测到的肠球菌菌株与患者25的血液分离菌株相比，存在49-76个SNV的差异（每百万碱基对18-26个SNV）（补充表8）。类似地，几个S. aureus菌血症菌株似乎相关：患者10和21之间的菌血症存在710个SNV（每百万碱基对250个），患者3和5之间存在166个SNV（每百万碱基对58个），患者1和12之间存在729个SNV（每百万碱基对263个）（补充表8）。然而，需要注意的是，StrainSifter在每个样本中对主导菌株进行分析。因此，如果在不同个体中存在不同的主导菌株，可能会漏掉真实的传播事件。

在血液分离菌株基因组中的抗生素耐药基因预测

对于同一物种的不同分离菌株，抗生素耐药谱相似。值得注意的是，与匹配的肠道样本（患者13的表皮葡萄球菌菌血症）一致的表皮葡萄球菌分离菌株具有比其余表皮葡萄球菌分离菌株更多的预测抗生素耐药基因。MFS代表主要促进者超家族；RND代表耐药性结节分裂。

最后，我们探究了来自不同患者的密切相关菌株是否也在功能上存在关联。我们比较了计算机预测的（图3和补充表12）以及临床上的抗生素抗性情况（补充表13），针对每个患者的菌血症样本进行了比较。我们发现预测的抗生素耐药性结果与临床结果高度一致。正如之前提到的，患者3和患者11的大肠杆菌菌血症分离株在系统发育上相关，差异较小（每百万碱基对60个SNV）。功能分析显示，患者3的菌血症样本中包含编码CTX-M的基因，而患者11的菌血症样本中不含有该基因。CTX-M是一种广谱β-内酰胺酶，可以使大多数青霉素和头孢菌素失去作用。正如预测的那样，临床测试确认了患者3的菌血症对大多数青霉素和头孢菌素具有耐药性，而患者11的菌血症则没有。相比之下，患者7的大肠杆菌菌血症菌株与患者3的菌株相比有24,088个SNV的差异（每百万碱基对7,390个SNV），但它显示出类似的预测和临床广谱β-内酰胺酶活性，这也可能是由CTX-M所致。系统发育相关的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌血症表现出类似的预测和临床表型。例如，被MecR1介导的甲氧西林耐药性在密切相关的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌血症（3和5号患者）中被预测和存在（图3和补充表12、13）。与菌血症3和5相比，与它们密切相关但与之远离的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌血症1和12缺乏编码MecR1的基因，并且对甲氧西林敏感。

总之，使用StrainSifter进行详细分析使我们能够准确全面地确定各种菌血症的候选源。尽管将全基因组测序（WGS）纳入实时患者管理中存在很大的热情，但目前，样本制备和测序周期的挑战限制了这些方法在临床护理中的应用。然而，全基因组测序在医院流行病学研究中扮演着越来越重要的角色。在感染发生之前对肠道菌群动态进行表征可能有助于准确确定潜在的病原体库，从而实现更好的医院感染预防和管理策略。

所呈现的结果暗示了肠道菌群可能是肠道和非肠道微生物的来源。然而，由于本研究仅采样了粪便菌群，我们不能排除相同病原菌株在多个身体部位定植的可能性，这可能是感染的来源。此外，尽管StrainSifter可以准确识别基因组和宏基因组之间的共享变异，但它仅限于对社群中给定生物的优势菌株进行分析。然而，研究表明肠道宏基因组通常只包含每个物种的一种优势菌株，因此在许多情况下，StrainSifter很可能能够很好地发挥作用。

在未来，我们预计高分辨率的基于全基因组测序的菌株比较将有助于发现更多通常在肠道菌群中发现的非肠道微生物的情况，这一模型在这里得到了支持。这一认识可以作为对改善肠道菌群多样性疗法的不断增长的研究的补充，并可以指导增强对病原体的定植抵抗力的努力。此外，更准确地确定菌血症的起源可能会影响医院和医疗保健提供者如何最有效地预防感染。借助这些强大的基因组工具，我们预计精确的源头识别和菌株追踪将引导我们进入一种新的、更为精确的传染病模型。