关于链特异性的RNA-seq测序

为什么要进行链特异性的测序？

首先我们看一下传统测序（非链特异性测序）存在的问题：

https://www.researchgate.net/figure/mRNA-library-construction-workflow-for-Illumina-from-David-Corney-2013_fig1_323731847

普通的RNA-seq，一段原始的RNA序列，完成cDNA的合成后，我们无法得知哪一条链是原始的了，再加上Y型接头，进行PCR扩增后，有的原始片段可能5‘连接的是P5，有的可能连的P7，所以最后测到的序列一半和原始序列的方向相同一半相反，无法得知序列来自DNA的那一条链。

https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-015-1876-7

https://htseq.readthedocs.io/en/master/htseqcount.html

基因ICAM4在正链上，基因CTD-2369P2.8在负链上。基因ICAM4和基因CTD-2369P2.8是在正负链上相互重叠的基因。在non-stranded RNA-seq中，所有reads被同时比对到基因ICAM4和基因CTD-2369P2.8，使用htseq-count计数时重叠区域的ambiguous reads计数被排除在外，因此结果显示基因ICAM4没有表达。(所有基因、转录物和序列读数如果在“+”链中，则显示为蓝色，如果在“−”链中则显示为绿色)

如何解决这个问题？

首先看一下HISAT2的命令参数--rna-strandness，其作用的用于指定strand-specific的信息。默认情况下是unstranded。

• For single-end reads, use F or R.
  • ‘F’ means a read corresponds to a transcript.
  • ‘R’ means a read corresponds to the reverse complemented counterpart of a transcript.
• For paired-end reads, use either FR or RF.
  • With this option being used, every read alignment will have an XS attribute tag:（每个读取对齐都将有一个XS属性标记）
  • ’+’ means a read belongs to a transcript on ‘+’ strand of genome.
  • ‘-‘ means a read belongs to a transcript on ‘-‘ strand of genome.

这里很容易理解，以单端测序为例，只要确保reads的方向与转录本的方向相同或相反就行。这里假设reads的方向与转录本的方向相同，HISAT2在将reads回贴到基因组时，如果reads的反向互补贴到

模拟一下这个过程

根据gtf文件从fastq文件中提取转录本序列

grep ENSG00000100271 ../genomic/chr22_with_ERCC92.gtf > TTLL1.gtf
grep ENSG00000100304 ../genomic/chr22_with_ERCC92.gtf > TTLL12.gtf
gffread -w TTLL12_transcripts.fa -g ../genomic/chr22_with_ERCC92.fa TTLL12.gtf
# hisat2 --new-summary -p 30 \
#     -x ../hisat2_index/chr22_with_ERCC92 \
#     --dta --rna-strandness RF \
#     -U out.fq \
#     | samtools view -bS - | samtools sort - -o out.bam  
hisat2 --new-summary -p 30 \
    -x ../hisat2_index/chr22_with_ERCC92 \
    -U out.fq \
    -S out.sam 2> out.txt
samtools view -bS out.sam -o out.bam
samtools sort out.bam -o out.sort.bam
samtools index out.sort.bam

保留RNA-Seq链的信息方法

图片alt

图片alt

https://www.biostars.org/p/70833/