illumina

• reads特点：单序列测序reads理论仅为300bp，准确率99.9%
• 通量特点：通量高，一个反应即可测通一个基因组
• 成本（提取费用+建库+测序）：单碱基费用低，主要用于对reads长度要求不高的研究中
  • RNA-seq提取费用贵
  • Hi-C建库费用高
  • DNA重测序：测序费用高
• 应用：微生物基因组的组装，重测序（snp、indel、小尺度结构变异），转录组测序

Illumina测序仪的发展史

1 illumina sequencing workflow

1.1 sample prep

• DNA片段末端添加接头

1.2 cluster generation

• 桥式PCR扩增
  
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• 扩增完成后，反向链被洗去，仅留下正链
  
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1.3 sequencing

• 边合成边测序
  
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• 桥式PCR，洗去正义链，仅留下反义链
  
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1.4 data analysis

1.5 pair-end VS single-end

链特异性测序

https://www.jianshu.com/p/dc664dde4ffe

链特异性测序的目的就是保证绝大多数的read1都和基因方向相同（或相反）

read1\read2产生

测序仪读取序列的时候是由先后顺序的，因为P7接头首先和flowcell结合。
于是先按read1 primer的方向读取read1，再按read2 primer的方向读取read2。
如果保证每个插入片段，都按同样的方向加上接头（比如5‘加P5接头，3’加P7接头），那么，测序的时候就会先测插入片段的5'端，再测插入片段的3‘端，插入片段的方向就可以确定了

传统RNA-seq测序

普通的RNA-seq，一段原始的RNA序列，完成cDNA的合成后，我们无法得知哪一条链是原始的了，再加上Y型接头，进行PCR扩增后，有的原始片段可能5‘连接的是P5，有的可能连的P7，所以最后测到的序列一半和原始序列的方向相同一半相反，无法得知序列来自DNA的那一条链。

链特异性的RNA-seq测序

利用dUTP掺入的方法，在加Y型接头之后，可以把第二链消化，留下反转录得到的第一条链，于是，第一链的5’端总和P5(P7)相连，可以得知测序得到序列的方向。

基因ICAM4在正链上，基因CTD-2369P2.8在负链上。基因ICAM4和基因CTD-2369P2.8是在正负链上相互重叠的基因。在non-stranded RNA-seq中，重叠区域的ambiguous reads计数被排除在外，这解释了ICAM4为什么没有表达。

All genes, transcripts, and sequence reads are colored in blue if they are in the “+” strand and colored in green if in the “−“ strand