转录组-序列回帖-TopHat

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1 双端测序reads的方向与转录本的方向问题

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传统的illumina测序，无法得知哪一个reads的方向与转录本方向一致，哪一个与转录本反向互补

2 junction reads需要正确断开

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具体的解决方法包块：join exon、split reads

2.1 join exon

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• 构建所有可能的junction的库，即所有可能的外显子拼接
• 可以发现以前未知的exon
• 缺点：不能发现新的exon

2.2 split reads

• 将 junction reads切割为更小的片段mapping到基因组
• 可以发现新的exon

3 TopHat

tophat [options]* <genome_index_base> <reads1_1[,...,readsN_1]> [reads1_2,...readsN_2]

• -r/--mate-inner-dist <int>：插入片段长度，将RNA打断为300bp的小片段，两端测序75bp的reads，中间插入片段长度为150bp
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• --mate-std-dev <int>：插入片段长度的标准差
• -G/--GTF <GTF/GFF3 file>：基因组已有的注释文件，首先将reads回帖到转录组，没有回帖到转录组的回帖到基因组，junction reads可以直接回帖到转录本
• --library-type：默认是fr-unstranded，确定数据是是否为either fr-firststrand or fr-secondstrand

3.1 先决条件

wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/geo/series/GSE32nnn/GSE32038/suppl/GSE32038%5Fsimulated%5Ffastq%5Ffiles%2Etar%2Egz
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release 90/fasta/drosophila_melanogaster/dna/Drosophila_melanogaster.BDGP6.dna.toplevel.fa.gz

GSE32038双端测序数据

3.2 建立参考基因组索引

• Index and annotation downloads
• bowtie2-build

bowtie2-build Drosophila_melanogaster.BDGP6.dna.toplevel.fa genome

3.3 reads回帖到参考基因组

tophat  -p 16 -G ../data/reference/Saccharomyces_cerevisiae.R64-1-1.48.gtf  -o EV_3  ../data/reference/genome ../data/RAN_seq/SRR1916152.fastq

参考

• Explore Transcriptome using NGS
• TopHat‐Cufflinks
• RNAseq tutorial
• Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks