DNA和RNA的提取
最后发布时间:2020-03-16 17:17:57
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核酸分离与纯化的一般原则
- 保持核酸分子一级结构的完整性。
- 排除其它分子的污染，保证核酸的纯度。
核酸分离与纯化的要求
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简化步骤、缩短时间、减少有害因素对核酸的破坏
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减少化学因素对核酸的降解（PH 4~10）
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防止核酸的生物降解（细胞内外各种核酸水解酶）
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DNA酶需要金属离子Mg^{2+}、Ca^{2+}的激活，因此使用金属离子螯合剂
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RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中主要危害因素
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减少物理因素对核算降解
核酸制备的基本步骤
graph TB
A[准备材料]--> B[破碎细胞或包膜-内容物释放]
B-->C[核酸分离]
C-->D[沉淀或吸附核酸 纯化并去除杂志]
D-->F[核酸溶解在适量缓冲液或水中]
破碎细胞的常用方法
- 液氮研磨法
- 高速组织捣碎机破碎法
- 玻璃匀浆器匀浆法
- 超声波处理法
- 生化法（溶菌酶、维生素酶）
- 化学处理方法（SDS、吐温80）
核酸分离，去除蛋白质
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加入SDS
破坏细胞膜，抑制核酸酶，使核酸从蛋白质上游离出来。
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加入浓盐溶液（NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚。
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酚/氯仿抽提
增加去除蛋白质的效果，并对核酸酶有抑制作用。
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沉淀核酸
去除溶液中某些盐离子杂质。
核酸的有机溶液沉淀法
当核酸溶液的PH>4时，核酸分子呈多聚阴离子状态。
钾、钠、镁及铵根等
阳离子形成盐，通过屏蔽带负电荷的磷酸基团使DNA分子聚集在一起而不溶于许多有机溶剂。
乙醇作为核酸沉淀剂的优缺点
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优点：
对盐类沉淀少，沉淀中所含小剂量乙醇易挥发除去，不影响后续实验。
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缺点：
需要量大，一般要求低温操作。
异丙醇作为核酸沉淀剂的优缺点
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优点：
需要体积小，速度快，适于低浓度、体积大的DNA样品沉淀。不需要低温放置。
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缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀，异丙醇难以挥发除去。
聚乙二醇作为核酸沉淀剂的优缺点
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优点：
可选择利用不同的
PEG沉淀相对分子质量不同的DNA片段
基因组DNA提取的注意事项
- 材料准备
- 最好使用新鲜材料，低温保存样品材料不要反复冻融
- 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）
- 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解
- 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
质粒的提取个纯化
- 质粒的结构：超螺旋、半开环、线性DNA
- 理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和抗变性能力更强
