核酸分离与纯化的一般原则

核酸分离与纯化的要求

核酸制备的基本步骤

graph TB A[准备材料]--> B[破碎细胞或包膜-内容物释放] B-->C[核酸分离] C-->D[沉淀或吸附核酸 纯化并去除杂志] D-->F[核酸溶解在适量缓冲液或水中]

破碎细胞的常用方法

核酸分离,去除蛋白质

  1. 加入SDS

    破坏细胞膜,抑制核酸酶,使核酸从蛋白质上游离出来。

  2. 加入浓盐溶液(NaCl)

    核酸-蛋白质加入NaCl后,破坏静电吸力,使氢键破坏,核蛋白解聚。

  3. 酚/氯仿抽提

    增加去除蛋白质的效果,并对核酸酶有抑制作用。

  4. 沉淀核酸

    去除溶液中某些盐离子杂质。

核酸的有机溶液沉淀法

当核酸溶液的PH>4时,核酸分子呈多聚阴离子状态。

钾、钠、镁及铵根等阳离子形成盐,通过屏蔽带负电荷的磷酸基团使DNA分子聚集在一起而不溶于许多有机溶剂。

乙醇作为核酸沉淀剂的优缺点

  1. 优点:

    对盐类沉淀少,沉淀中所含小剂量乙醇易挥发除去,不影响后续实验。

  2. 缺点:

    需要量大,一般要求低温操作。

异丙醇作为核酸沉淀剂的优缺点

  1. 优点:

    需要体积小,速度快,适于低浓度、体积大的DNA样品沉淀。不需要低温放置。

  2. 缺点:

    易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀,异丙醇难以挥发除去。

聚乙二醇作为核酸沉淀剂的优缺点

  1. 优点:

    可选择利用不同的PEG沉淀相对分子质量不同的DNA片段

基因组DNA提取的注意事项

  1. 材料准备

质粒的提取个纯化

  1. 质粒的结构:超螺旋、半开环、线性DNA
  2. 理化性质:与一般核酸相似,但抗切割和抗变性能力更强