植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)革兰氏阳性、无孢子形成、兼性厌氧细菌,是大量存在于人体肠道的益生菌。
Regulation of Nir gene in Lactobacillus plantarum WU14 mediated by GlnR
很多革兰氏阳性细菌基因组中,都存在glnR基因,其编码蛋白GlnR是一种转录调控因子。GlnR参与氮代谢、磷酸代谢。
通过对 GenBank 现存的Nir 及蛋白保守序列进行分析,设计植物乳杆菌WU14 特异性引物,扩增出了大小约为1638bp 的 Nir。通过各种生物信息分析软件对Nir的蛋白质一、二、三级结构进行分析发现,植物乳杆菌WU14的 Nir蛋白为胞内酶,不存在信号肽和跨膜结构。构成该酶的主要结构为a-螺旋和无规则卷曲。这为酶学性质的研究提供了一定基础。
为了研究重组 Nir的酶活性,构建了pRNA48-Nir食品级高效诱导表达载体,并通过电转化获得了重组菌L.lactis NZ9000/pRNA48-Nir。该重组菌在经过30ng/mL的nisin 诱导12h 后能够在SDS-PAGE后出现与预期大小相符的特异性蛋白条带。分析重组菌降解亚硝酸盐的能力显示重组菌在含0.04% NaNO:的培养液中 24h 后NaNO₂的降解量最大,达到22.21μg/mL,酶活性为925.41U/mL。与植物乳杆菌WU14的亚硝酸盐降解量相比,该重组菌的亚硝酸盐降解能力不到原始菌株的40%,其原因可能是Nir在上游可能还存在相应的操纵子结构来控制亚硝酸盐的降解,该操纵子结构还有待进一步发掘。由于迄今为止尚未见有关乳酸菌的Nir操纵子结构、功能及调控机制的报道,而这些问题正是乳酸菌氮代谢的分子调控机制研究和消除发酵食品和饲料中亚硝酸盐污染中亟待解决的关键问题。这里仅就有关乳酸菌亚硝酸盐降解的研究做了一些基础性工作,对寻找安全、有效控制或降解亚硝酸盐的生物降解法,为Nir 在食品中应用奠定了基础,进而保障食品安全,保护人类健康。
使用CTAB法提取植入物乳杆菌WU14全基因组为模板,通过特异性引物NitF和NirR扩增Nir,得到大小约为1700bp的特异性条带。测序结果表明该序列与Nir假设蛋白基因相似性最高,也与硝酸盐还原酶基因相似性较高。将Nir与pGEM-T载体连接,热激转入大肠杆菌DH5a感受态细胞中,通过蓝白斑氨苄抗性平板筛选白色菌落,然后进行菌落PCR,挑选PCR扩增基因片段在1700bp左右的阳性克隆,用含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体扩增培养,保存菌种,以便于下一步表达分析。