reads去重复
RNA-seq一般不去重复: In RNA-Seq however, apart from the technical PCR duplicates, there is a strong source for biological read duplicates: for a given gene length and sequencing depth there exists an expression level beyond which it is not possible to add place more reads inside a gene locus without placing a second read exactly on the position of an already existing read. (然而，在RNA-Seq中，除了技术上的PCR重复之外，还有一个强大的生物读数重复来源：对于给定的基因长度和测序深度，存在一个表达水平，超过这个水平，如果不将第二个读数准确地放在已经存在的读数的位置上，就不可能在基因座内添加更多的读数。)
- DNA-based assay: For common DNA-based assays PCR duplicates are often simply removed before further analysis and their overall fraction or the read multiplicity taken as quality metrics.
- ChIP-seq一般去重复
- call SNP一般去重复
万事无绝对，还需参考起始量和PCR扩增数判断是否去重复。reads mapping覆盖均匀度可以判断是否需要去重复。
PCR去重工具首选Picard
根源上解决去重复问题：起始量高，循环数少，reads能长不短，能双端不单端
PCR重复的危害
理论上来讲，不同的序列在进行PCR扩增时，扩增的倍数应该是相同的。但是由于聚合酶的偏好性，PCR扩增次数过多的情况下，会导致一些序列持续扩增，而另一些序列扩增到一定程度后便不再进行，也就是我们常说的PCR偏好性。
这种情况对于定量分析（如ChIP-seq），会造成严重的影响。此外，PCR扩增循环数过多，会出现一些扩增偏差，进而影响一些突变识别（比如call SNP)的置信度。
因此，在一些NGS分析流程中需要考虑去除PCR重复。
常用的去重工具
测序所得到的reads是由于超声波或者酶切断裂得到的，因此这些reads比对到基因组上的位置是完全随机的。那么两个reads比对到相同位置的概率是非常低的。如果两个reads比对情况相同或者极其相似，则很有可能是由于PCR重复所导致的。而我们常用的去重工具主要也是遵循这一思想。
samtools rmdup
如果多个reads具有相同的比对位置时，rmdup将它们标记为duplicates，然后去除重复，通常只保留第一个识别到的reads。
该方法对于以下两种情况，有很好的去除效果：
- 一些reads由于测序错误导致其不完全相同
- 比对错误导致不同的序列比对到相同的位置（可能性不大）
该方法的缺点：由于samtools去重只考虑reads比对上的起始终止位置，不考虑比对情况，这种去重有时会导致测序信息的丢失。
Picard
该工具的MarkDuplicates方法也可以识别duplicates。但是与samtools不同的是，该工具仅仅是对duplicates做一个标记，只在需要的时候对reads进行去重。而samtools的rmdup则是直接将其识别出来的重复reads去掉。
该工具的另一个不同之处在于它不仅考虑reads的比对位置，还会考虑其中的插入错配等情况（即会利用sam/bam文件中的CIGAR值），甚至reads的tail，lane以及flowcell。Picard主要考虑reads的5'端的比对位置，一个每个reads比对上的方向。
因此我们可以从一定程度上认为，5'端的位置，方向，以及碱基比对情况相同，Picard就将这些reads中碱基比对值Q>15的看作是best pair而其他的reads则当作是duplicate reads。甚至当reads的长度不同时，Picard依然利用上述原理进行去重。
对Picard来说，reads的5'端信息更为重要.若duplicates是PCR重复，那么它们的序列不一定完全相同。但是由于PCR扩增时，酶的前进方向是5'->3'方向，PCR重复序列中5'端的部分相似的可能性更高。
如何判断是否需要去除重复？
在illumina测序中，通常有两种类型的重复，分别是光学重复和PCR重复，PCR重复就不用多说了，就是在建库过程中PCR扩增导致的重复。那么什么是光学重复呢？具体如下图所示，它是由于illumina测序时照相机错误的的将一个簇识别为两个簇（多个），这就会导致产生完全一样的reads。该重复可以利用tail的坐标进行去除。
当我们做RNA-seq时，我们所得到的reads覆盖度通常是不均匀的（由于不同的基因表达水平不同），如果我们不加考虑的直接remove duplicate，将会导致许多重要信息的丢失。
RNA-seq由于其建库起始量一般都很高所以不需要去除重复，而且RNA-seq数据中经常会出现某些基因的表达量十分高，这就导致这些基因打断的reads的比对情况有很大概率是一致的。
而ChIP-seq中，由于起始量不高，且没有那种富集程度很高的位点，因此通常需要考虑去除PCR重复。
至于call SNP，起始量一般都高（因为要保证测序深度），此外由于PCR扩增会导致一些序列复制错误，这将严重影响SNP位点识别的置信度。因此一般需要去重复。
利用reads mapping的均匀程度判断是否具有重复。若富集位点周围的reads均匀覆盖，那么没有重复；若富集位点周围覆盖度不均匀，某些区域猛然升高，那么很有可能需要进行PCR去重复
总结
- 起始量很多时，不需要去重复
- 扩增数很少时，15个cycle以内，不需要去重复
- 双端测序由于其两个reads的位置矫正，有助于去除PCR重复
- reads长度越长，越容易识别真正的PCR重复
