基因工程期末考试
1. 绪论
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什么是基因工程?
基因工程是指按照人们的愿望,经过严密的设计,将一种或多种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。(基本特点:分子水平操作,细胞水平表达) -
基因工程标志性的拐点代表性人物
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研究基因重组技术获得诺贝尔奖的科学家
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三大技术发明和三大理论发现
- 理论上的三大发现:
- DNA是遗传物质
- DNA的双螺旋结构和半保留复制
- 遗传信息的传递方式--中心法则
- 技术上的三大发明:
- 限制性核酸内切酶和DNA连接酶;(标志着DNA重组时代的开始)
- 基因工程载体
- 大肠杆菌转化体系的建立。或1970年,逆转录酶的发现
- 理论上的三大发现:
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基因工程的操作顺序:
切、接、转、增、检、表 -
基因工程的核心技术 :
2. 分子克隆工具酶
2.1 限制性内切酶
- 限制性内切酶分类:
按照限制性核酸内切酶对辅助因子的需求与否,以及切割DNA链的特点,将已发现的限制性内切酶分为3种类型:I、Ⅱ、型:
Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | |
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酶分子 | 内切酶与甲基化酶分子 不在一起 | 三亚基双工酶 | 二亚基双工酶 |
识别位点 | 4~6bp,大多数为回文 对称结构 | 二分非对称 | 5~7bp非对称 |
切割位点 | 在识别位点中或靠近 识别位点 | 无特异性,至少在识别位 点外1000bp | 在识别位点下游24~26bp |
限制反应与甲基化反应 | 分开反应 | 互斥 | 同时竞争 |
限制作用是否需要ATP | 否 | 是 | 是 |
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限制性内切酶作用特点
- 有严格的识别、切割的DNA序列,并以内切的方式水解双链DNA分子中的磷酸二酯键,产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH。
- 识别序列一般为4~6个碱基对,并以切割序列的正中作为轴心,成180°反向重复(inverted repeat)。这种结构也称为回文结构(palindrom)。
- Ⅱ型酶切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短,即识别序列短,则DNA链中可能存在的切点多,产生DNA片段短;识别序列长,则DNA链上存在的切点少,产生DNA片段长。按照识别序列的长短可估算RE(限制性核酸内内切酶)对DNA的切割概率。如:识别4bp的某RE,其切割概率为1/44=1/256,即平均相距256bp有一个切割点;识别序列为6bp的RE,其切割概率1/46=1/4096。
- 切割后产生平头或黏性末端。
- Ⅱ型RE酶只需Mg2+, 不需ATP。
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黏末端(matched end,cohevise end):识别位点为回文对称结构[1]的序列经限制酶切割后,产生的末端为匹配黏末端
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平末端(blunt end):在回文对称结构上同时切割DNA的两条链,则产生平末端
ppt 内容
- 平头末端(blunt end) 即在识别序列的对称轴上进行切割,例如Hae Ⅲ识别序列为5’-GGCC-3’,其切点在G与C之间;
- 黏性末端(cohesive end) 即在识别序列的两个对称点切开DNA双链,产生末端带有单链尾巴的切口。黏性末端又可分为两种:从DNA分子5’端切割产生5’端突出的黏性末端称为5’黏性末端.如EcoRI;从3’端切割产生3’端突出的黏性末端称为3’黏性末端,如Pst I。
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星星活性(信号活性star activity):在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变称为星星活性。
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以下序列中最有可能被二型限制性核酸内切酶识别的是?
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限制性内切酶活性发挥的影响因素?
- DNA的纯度
- DNA的甲基化程度
- 酶切反应的温度(通常为37℃ )
- DNA的分子结构
- 核酸内切限制酶的缓冲液
2.2 DNA聚合酶
- klenow片段(DNA聚合酶Ⅰ大片段)和DNA聚合酶Ⅰ(全酶)之间有什么关系
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DNA聚合酶I的相对分子质量为109000,是一条约1000个氨基酸残基的多肽链。它具有三种活性:
- 5'→3' DNA聚合酶活性
- 3'→5' 外切核酸酶活性
- 5'→3' 外切核酸酶活性
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大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)Klenow片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I产生的,也可通过克隆技术而获得。它的相对分子质量是76000,为一条单多肽链。
- 5'→3' DNA聚合酶活性
- 3'→5' 外切核酸酶活性
无5'→3' 外切核酸酶活性
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2.3 核酸末端修饰酶
- DNA重组时,防止自身环化 ,未加入外源基因方式接口发生连接
- 碱性磷酸酶,去磷酸化,防止自我连接,以增加重组率
- 磷酸激酶,磷酸化
2.4 其它分子克隆工具酶
- 进行DNA分子末端标记的酶
3. 分子克隆载体
3.1 质粒
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基本特征:
- 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制
- 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现象称为质粒的不相容性
- 具有可转移性
- 携带一个或多个遗产标记基因
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构建:
` -
植物转基因Ti质粒
- 结构:
- 作用机理:
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质粒和病毒杂合体
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质粒载体的组成:
- 复制起始点
- 插入外源基因的多克隆位点
- 筛选标记基因
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CCC DNA:
- 共价
- 封闭
- 环状
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考斯质粒(cosmid),将质粒与病毒噬菌体两者优点结合,形成新的分子克隆载体,如何拼装?
复制子来自质粒
3.2 酵母人工染色体载体(YAC)
最大装载能力和装载量
3.3 细菌人工染色体载体(BAC)
最大装载能力和装载量
4. 基因工程中大分子的分离和检测
4.1 凝胶电泳
- 琼脂糖凝胶电泳
- 聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 脉冲场凝胶电泳
4.2 分子杂交
- Southern杂交
- Northern杂交
- Western杂交
4.3 PCR技术
- 反应流程
- 反体系组分
- DNA分子杂交的基本原理
5. DNA测序方法
5.1 传统DNA测序方法
- 化学降解法测序
- 双脱氧终止法
名称解释
- RNA干扰技术(iRNA):
- PDGS(转录以后的基因沉默):
- 基因组文库:
- CDN文库:
- 考斯质粒(cosmid):
- Southern杂交:
- 反转录PCR(RT-PCR):
选择
- 以下那一项不属于基因工程技术
- 哪一些实践与基因工程无关
- 载体的转载容量排序
- 以下序列最有可能被Ⅱ型酶识别的是
简答
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野生型载体不能直接用来作基因工程载体的原因?
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷,不能满足克隆载体的要求,因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建 -
克隆编码某种蛋白质的基因考虑表达的三个基本条件?
表达的三个基本条件
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蓝白斑筛选
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人工感受态细胞的制备?
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载体构建,外源基因插入载体使载体筛选标记基因失活(LCZ基因,IPTG作用)P44
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回文对称结构:双链DNA中含有的结构相同、方向相反的序列。例如5'GGTACC3' 3'CCATGG5'
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