• 1. 绪论
• 2. 分子克隆工具酶
  • 2.1 限制性内切酶
  • 2.2 DNA聚合酶
  • 2.3 核酸末端修饰酶
  • 2.4 其它分子克隆工具酶
• 3. 分子克隆载体
  • 3.1 质粒
  • 3.2 酵母人工染色体载体（YAC）
  • 3.3 细菌人工染色体载体（BAC）
• 4. 基因工程中大分子的分离和检测
  • 4.1 凝胶电泳
  • 4.2 分子杂交
  • 4.3 PCR技术
• 5. DNA测序方法
  • 5.1 传统DNA测序方法
• 名称解释
• 选择
• 简答

1. 绪论

• 什么是基因工程？
  基因工程是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。（基本特点：分子水平操作，细胞水平表达）

• 基因工程标志性的拐点代表性人物

• 研究基因重组技术获得诺贝尔奖的科学家

• 三大技术发明和三大理论发现

  • 理论上的三大发现：
    • DNA是遗传物质
    • DNA的双螺旋结构和半保留复制
    • 遗传信息的传递方式--中心法则
  • 技术上的三大发明：
    • 限制性核酸内切酶和DNA连接酶；（标志着DNA重组时代的开始）
    • 基因工程载体
    • 大肠杆菌转化体系的建立。或1970年，逆转录酶的发现

• 基因工程的操作顺序：
  切、接、转、增、检、表

• 基因工程的核心技术 ：

2. 分子克隆工具酶

2.1 限制性内切酶

• 限制性内切酶分类：

按照限制性核酸内切酶对辅助因子的需求与否，以及切割DNA链的特点，将已发现的限制性内切酶分为3种类型：I、Ⅱ、型：

• 限制性内切酶作用特点

  • 有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA分子中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。
  • 识别序列一般为4～6个碱基对，并以切割序列的正中作为轴心，成180°反向重复(inverted repeat)。这种结构也称为回文结构(palindrom)。
  • Ⅱ型酶切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短，即识别序列短，则DNA链中可能存在的切点多，产生DNA片段短；识别序列长，则DNA链上存在的切点少，产生DNA片段长。按照识别序列的长短可估算RE(限制性核酸内内切酶)对DNA的切割概率。如：识别4bp的某RE，其切割概率为1/44=1/256，即平均相距256bp有一个切割点；识别序列为6bp的RE，其切割概率1/46=1/4096。
  • 切割后产生平头或黏性末端。
  • Ⅱ型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。

• 黏末端（matched end，cohevise end）：识别位点为回文对称结构^[1]的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配黏末端

• 平末端（blunt end）：在回文对称结构上同时切割DNA的两条链，则产生平末端

ppt 内容

• 平头末端(blunt end) 即在识别序列的对称轴上进行切割，例如Hae Ⅲ识别序列为5’-GGCC-3’，其切点在G与C之间；
• 黏性末端(cohesive end) 即在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链尾巴的切口。黏性末端又可分为两种：从DNA分子5’端切割产生5’端突出的黏性末端称为5’黏性末端．如EcoRI；从3’端切割产生3’端突出的黏性末端称为3’黏性末端，如Pst I。

• 星星活性（信号活性star activity）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变称为星星活性。

• 以下序列中最有可能被二型限制性核酸内切酶识别的是？

• 限制性内切酶活性发挥的影响因素？

  • DNA的纯度
  • DNA的甲基化程度
  • 酶切反应的温度（通常为37℃ ）
  • DNA的分子结构
  • 核酸内切限制酶的缓冲液

2.2 DNA聚合酶

• klenow片段(DNA聚合酶Ⅰ大片段)和DNA聚合酶Ⅰ（全酶）之间有什么关系

  • DNA聚合酶I的相对分子质量为109000，是一条约1000个氨基酸残基的多肽链。它具有三种活性：

    • 5'→3' DNA聚合酶活性
    • 3'→5' 外切核酸酶活性
    • 5'→3' 外切核酸酶活性

  • 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)Klenow片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I产生的，也可通过克隆技术而获得。它的相对分子质量是76000，为一条单多肽链。

    • 5'→3' DNA聚合酶活性
    • 3'→5' 外切核酸酶活性
    • 无5'→3' 外切核酸酶活性

2.3 核酸末端修饰酶

• DNA重组时，防止自身环化 ，未加入外源基因方式接口发生连接
  • 碱性磷酸酶，去磷酸化，防止自我连接，以增加重组率
  • 磷酸激酶，磷酸化

2.4 其它分子克隆工具酶

• 进行DNA分子末端标记的酶

3. 分子克隆载体

3.1 质粒

• 基本特征：

  • 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制
  • 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性
  • 具有可转移性
  • 携带一个或多个遗产标记基因

• 构建：
  `

• 植物转基因Ti质粒

  • 结构：
  • 作用机理：

• 质粒和病毒杂合体

• 质粒载体的组成：

  • 复制起始点
  • 插入外源基因的多克隆位点
  • 筛选标记基因

• CCC DNA：

  • 共价
  • 封闭
  • 环状

• 考斯质粒（cosmid），将质粒与病毒噬菌体两者优点结合，形成新的分子克隆载体，如何拼装？
  复制子来自质粒

3.2 酵母人工染色体载体（YAC）

最大装载能力和装载量

3.3 细菌人工染色体载体（BAC）

最大装载能力和装载量

4. 基因工程中大分子的分离和检测

4.1 凝胶电泳

• 琼脂糖凝胶电泳
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 脉冲场凝胶电泳

4.2 分子杂交

• Southern杂交
• Northern杂交
• Western杂交

4.3 PCR技术

• 反应流程
• 反体系组分
• DNA分子杂交的基本原理

5. DNA测序方法

5.1 传统DNA测序方法

• 化学降解法测序
• 双脱氧终止法

名称解释

• RNA干扰技术（iRNA）：
• PDGS（转录以后的基因沉默）：
• 基因组文库：
• CDN文库：
• 考斯质粒（cosmid）：
• Southern杂交：
• 反转录PCR（RT-PCR）：

选择

• 以下那一项不属于基因工程技术
• 哪一些实践与基因工程无关
• 载体的转载容量排序
• 以下序列最有可能被Ⅱ型酶识别的是

简答

• 野生型载体不能直接用来作基因工程载体的原因？
  天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建

• 克隆编码某种蛋白质的基因考虑表达的三个基本条件？

表达的三个基本条件

• 蓝白斑筛选

• 人工感受态细胞的制备？

• 载体构建，外源基因插入载体使载体筛选标记基因失活（LCZ基因，IPTG作用）P44