基因组的维持-DNA的结构和复制

图片alt

• DNA聚合酶的手掌域
• 聚合酶活性位点，添加新的dNTP，合成位点。结合两个金属离子，改变正确配对的dNTP和3'-OH周围的化学环境利于催化作用发生。
• 核酸外切酶活性位点，去除错误配对dNTP，校正位点
• DNA聚合酶的手指域
• 与新进入的dNTP结合，当配对正确时，手指域发生移动，关住dNTP使进入核苷酸与催化金属离子密切接触
• 与模板结合
• DNA聚合酶的拇指域
• 不直接参加催化反应
• 维持引物和活性位点的正确位置
• 帮助维持DNA聚合酶与其底物之间的较强结合

• DNA聚合酶的延伸能力
• DNA聚合酶沿DNA滑行的能力利于提高延伸能力两种与DNA的相互作用利于DNA聚合酶沿DNA滑行
• 核酸外切酶校正新合成DNA
• 影响DNA聚合酶准确度的主要因素是碱基有互变异构体，错误配对，通过校正外切核酸酶去除
• 外切核酸酶将碱基从错配DNA的3'端去除
• 外切核酸酶的作用是校正新合成的DNA

三、复制叉

图片alt

• 冈崎片段：在后随链上新合成的小片段DNA
• DNA新链的起始需要一条RNA引物，所有DNA聚合酶均需要有游离3'-OH的引物，DNA聚合酶不能从头起始新DNA链的合成
• RNA聚合酶可以从头起始新的RNA链的合成，能在引物酶作用下，在单链DNA模板上合成短RNA引物（5-10个核苷酸长度）
• 完成DNA复制需要去除RNA引物
• RNA酶H：识别并去除各条RNA引物的大部分，特异性的降解与DNA碱基配对的RNA，但是只能切除两个核糖核苷酸之间的键
• 5'外切核酸酶
• DNA聚合酶
• DNA连接酶

图片alt

• DNA解旋酶在复制叉之前解开双螺旋
• 催化双链DNA的两条链分离
• 需要消耗ATP
• 只有到达DNA末端时才释放
• 具有延伸性
• 复制前单链结合蛋白稳定单链DNA
• 单链结合蛋白（SSB）
• 拓扑异构酶去除DNA解旋在复制叉上产生的超螺旋
• 随着DNA链的分离，复制叉前的双链DNA变得更加正超螺旋化
• 保证持续复制，需要拓扑异构酶缓解超螺旋的积累
  
  图片alt

四、DNA聚合酶的特化

细胞中DNA聚合酶为行使不同的功能而被特化

• E.coli 至少有5种DNA聚合酶

• DNA聚合酶Ⅲ全酶：负责E.coli基因组复制的蛋白质复合物，有校正外切酶活性

• DNA聚合酶Ⅰ：去除E.coli 中起始DNA合成所需要的RNA引物，有校正外切酶活性
  专门用于去除起始DNA合成所需要的RNA引物，具有5'外切酶活性。延伸能力不强

• 其他三种参与DNA修复：无校正活性

• 真核生物聚合酶有15种以上

• 对基因组复制至关重要的有三种

• DNA聚合酶δ

• DNA聚合酶ε

• DNA聚合酶α/引物酶

• 四个亚基（两个亚基DNA聚合酶α、两个亚基引物酶），参与DNA心新链的起始

• DNA聚合酶α/引物酶延伸能力相对较低，所以很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或DNA聚合酶ε取代（聚合酶转换）

• DNA聚合酶的转化

• 滑动夹极大的增加DNA聚合酶的延伸能力
  

  图片alt

五、复制叉上的DNA合成

复制叉上前导链和后随链同时合成对限制细胞中单链DNA的量很重要

• E.coli DNA聚合酶Ⅲ全酶协调两条链同时复制

• DNA聚合酶Ⅲ包括：2个拷贝的核心DNA聚合酶Ⅲ，1个拷贝的无蛋白γ-复合物

• 复制体：所有在复制叉上起作用的蛋白质的总和，复制体通过蛋白质-蛋白质之间的相互作用形成。

• DNA解旋酶和DNA聚合酶Ⅲ全酶相互作用，由滑动夹装载器介导，激发解旋酶的活性

• DNA解旋酶和引物酶相互作用，激发引物酶的功能，紧密结合高频率的引物合成-较短的冈崎片段

六、DNA复制的起始

特定基因组DNA序列指导DNA复制的起始

• 复制起始位点：DNA解旋和复制起始发生的特殊位点
• 复制子：从复制起始位点开始复制的所有DNA，包含两个指导的DNA复制起始原件复制器、起始子、蛋白
• 在大肠杆菌中：真个染色体是一个复制子
• 在真核生物中：多个起始位点的存在将染色体分成多个复制子
• 复制器：足够指导DNA复制起始的整套顺式作用DNA序列
• 起始自蛋白：特异性识别复制器中的一个DNA元件并激活复制的起始，它是复制起始中涉及的唯一的序列特异性DNA结合蛋白
• 复制器序列包括起始子结合位点和容易解链的DNA
• 起始子蛋白结合位点：组装复制起始机器的核心
• 富含AT的一段DNA：容易解链
• E.coli 复制器称为ori C

图片alt

• 真核生物的起始子是起始位点识别复合物ORC

七、结合和解旋

起始子蛋白对复制起始位点的选择和激活

八、结束复制

• 后随链的合成不能复制线性染色体的最末端
• DNA合成起始需要RNA引物，带来线性染色体的末端问题
• 最后一个冈崎片段RNA引物的去除使染色体的末端产生一段没有复制的单链DNA
• 每一轮复制都将使两条子代DNA分子中一条被截短，最终导致染色体末端的丢失

图片alt

• 用蛋白质代替RNA作为每个染色体末端最后一个冈崎片段的引物

• 某些细菌病毒的线性染色体末端

• 端粒与端粒酶——多数真核生物使用的方法

• 真核生物染色体末端称为端粒

• 通常由首尾相接的富含TG的重复DNA序列构成，其3'端延伸于5'端之外形成单链DNA

• 这种特殊结构作为新的复制起始位点，该位点招募特殊的DNA聚合酶端粒酶

图片alt

图片alt