一、DNA合成的化学基础
- 四种脱氧核糖核苷三磷酸：dGTP、dCTP、dATP、dTTP
- 模板DNA：单链DNA
- 引物：与模板配对的短核苷酸链
- 焦磷酸水解是DNA合成的驱动力
二、DNA聚合酶的作用机制
- DNA聚合酶用一个
单一的活性位点催化DNA合成- 同一个活性位点催化4种脱氧核糖核苷三磷酸中任何一种的添加
- 具有识别不同dNTP的能力，不正确的碱基催化效率显著降低（动力学选择）
- DNA聚合酶通过对rNTP的空间位阻来区分rNTP和dNTP
- DNA聚合酶将rNTP排斥在DNA聚合酶活性位点之外
- DNA聚合酶的核苷酸结合口袋非常小无法容纳核苷酸上的2'-OH
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- DNA聚合酶的手掌域
- 聚合酶活性位点，添加新的dNTP，合成位点。结合两个金属离子，改变正确配对的dNTP和3'-OH周围的化学环境利于催化作用发生。
- 核酸外切酶活性位点，去除错误配对dNTP，校正位点
- DNA聚合酶的手指域
- 与新进入的dNTP结合，当配对正确时，手指域发生移动，关住dNTP使进入核苷酸与催化金属离子密切接触
- 与模板结合
- DNA聚合酶的拇指域
- 不直接参加催化反应
- 维持引物和活性位点的正确位置
- 帮助维持DNA聚合酶与其底物之间的较强结合
- DNA聚合酶的延伸能力
- DNA聚合酶沿DNA滑行的能力利于提高延伸能力两种与DNA的相互作用利于DNA聚合酶沿DNA滑行
- 核酸外切酶校正新合成DNA
- 影响DNA聚合酶准确度的主要因素是碱基有互变异构体，错误配对，通过校正外切核酸酶去除
- 外切核酸酶将碱基从错配DNA的3'端去除
- 外切核酸酶的作用是校正新合成的DNA
三、复制叉
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- 冈崎片段：在后随链上新合成的小片段DNA
- DNA新链的起始需要一条RNA引物，所有DNA聚合酶均需要有游离3'-OH的引物，DNA聚合酶不能从头起始新DNA链的合成
- RNA聚合酶可以从头起始新的RNA链的合成，能在引物酶作用下，在单链DNA模板上合成短RNA引物（5-10个核苷酸长度）
- 完成DNA复制需要去除RNA引物
- RNA酶H：识别并去除各条RNA引物的大部分，特异性的降解与DNA碱基配对的RNA，但是只能切除两个核糖核苷酸之间的键
- 5'外切核酸酶
- DNA聚合酶
- DNA连接酶
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- DNA解旋酶在复制叉之前解开双螺旋
- 催化双链DNA的两条链分离
- 需要消耗ATP
- 只有到达DNA末端时才释放
- 具有延伸性
- 复制前单链结合蛋白稳定单链DNA
- 单链结合蛋白（SSB）
- 拓扑异构酶去除DNA解旋在复制叉上产生的超螺旋
- 随着DNA链的分离，复制叉前的双链DNA变得更加正超螺旋化
- 保证持续复制，需要拓扑异构酶缓解超螺旋的积累
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四、DNA聚合酶的特化
细胞中DNA聚合酶为行使不同的功能而被特化
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E.coli 至少有5种DNA聚合酶
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DNA聚合酶Ⅲ全酶：负责E.coli基因组复制的蛋白质复合物，有校正外切酶活性
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DNA聚合酶Ⅰ：去除E.coli 中起始DNA合成所需要的RNA引物，有校正外切酶活性
专门用于去除起始DNA合成所需要的RNA引物，具有5'外切酶活性。延伸能力不强 -
其他三种参与DNA修复：无校正活性
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真核生物聚合酶有15种以上
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对基因组复制至关重要的有三种
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DNA聚合酶δ
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DNA聚合酶ε
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DNA聚合酶α/引物酶
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四个亚基（两个亚基DNA聚合酶α、两个亚基引物酶），参与DNA心新链的起始
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DNA聚合酶α/引物酶延伸能力相对较低，所以很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或DNA聚合酶ε取代（聚合酶转换）
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DNA聚合酶的转化
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滑动夹极大的增加DNA聚合酶的延伸能力
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五、复制叉上的DNA合成
复制叉上前导链和后随链同时合成对限制细胞中单链DNA的量很重要
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E.coli DNA聚合酶Ⅲ全酶协调两条链同时复制
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DNA聚合酶Ⅲ包括：2个拷贝的核心DNA聚合酶Ⅲ，1个拷贝的无蛋白γ-复合物
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复制体：所有在复制叉上起作用的蛋白质的总和，复制体通过蛋白质-蛋白质之间的相互作用形成。
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DNA解旋酶和DNA聚合酶Ⅲ全酶相互作用，由滑动夹装载器介导，激发解旋酶的活性
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DNA解旋酶和引物酶相互作用，激发引物酶的功能，紧密结合高频率的引物合成-较短的冈崎片段
六、DNA复制的起始
特定基因组DNA序列指导DNA复制的起始
- 复制起始位点：DNA解旋和复制起始发生的特殊位点
- 复制子：从复制起始位点开始复制的所有DNA，包含两个指导的DNA复制起始原件复制器、起始子、蛋白
- 在大肠杆菌中：真个染色体是一个复制子
- 在真核生物中：多个起始位点的存在将染色体分成多个复制子
- 复制器：足够指导DNA复制起始的整套顺式作用DNA序列
- 起始自蛋白：特异性识别复制器中的一个DNA元件并激活复制的起始，它是复制起始中涉及的唯一的序列特异性DNA结合蛋白
- 复制器序列包括起始子结合位点和容易解链的DNA
- 起始子蛋白结合位点：组装复制起始机器的核心
- 富含AT的一段DNA：容易解链
- E.coli 复制器称为
ori C
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- 真核生物的起始子是起始位点识别复合物
ORC
七、结合和解旋
起始子蛋白对复制起始位点的选择和激活
八、结束复制
- 后随链的合成不能复制线性染色体的最末端
- DNA合成起始需要RNA引物，带来线性染色体的末端问题
- 最后一个冈崎片段RNA引物的去除使染色体的末端产生一段没有复制的单链DNA
- 每一轮复制都将使两条子代DNA分子中一条被截短，最终导致染色体末端的丢失
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用蛋白质代替RNA作为每个染色体末端最后一个冈崎片段的引物
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某些细菌病毒的线性染色体末端
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端粒与端粒酶——多数真核生物使用的方法
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真核生物染色体末端称为端粒
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通常由首尾相接的富含TG的重复DNA序列构成，其3'端延伸于5'端之外形成单链DNA
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这种特殊结构作为新的复制起始位点，该位点招募特殊的DNA聚合酶端粒酶
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