DAZAP1通过ERK信号通路促进KITLG的选择性剪接，促进多发性骨髓瘤细胞增殖

DAZAP1 facilitates the alternative splicing of KITLG to promote multiple myeloma cell proliferation via ERK signaling pathway^[1]

背景

多发性骨髓瘤(MM)是第二常见的恶性血液病。目前，复发和耐药是MM患者发病和死亡的主要原因。因此，阐明MM恶性增殖的机制，寻找治疗MM的新策略显得很有必要。真核转录本的选择性剪接(Alternative splicing, AS)是基因表达的重要组成部分，该机制拓宽了功能蛋白的多样性，从有限的基因，最终产生具有不同甚至相反功能的蛋白质。很多研究证据表明AS变化是肿瘤进展和治疗的重要标志。DAZAP1是一种RNA结合蛋白(RBP)，在多种组织中表达，参与转录后修饰，如AS。大量证据表明DAZAP1在多种癌症的调控中起着至关重要的作用。然而，DAZAP1在MM增殖中的作用及其机制尚不清楚。因此，在此项研究中，作者以可变剪切的方向入手，探讨了DAZAP1对MM细胞的增殖作用及其具体调控机制。

结果

高表达DAZAP1与MM患者生存期差有关

为了评估DAZAP1与MM的相关性，作者首先分析了GEP cohorts数据中DAZAP1表达情况。GSE5900的数据显示，与正常浆细胞相比，MM样本中的DAZAP1显著增加(图1A)。四个独立的GEP cohorts包括GSE2658、GSE9782、GSE19784和GSE136337数据显示，高表达DAZAP1与MM患者生存期差明显相关(图1B-F)。此外，作者还比较了基线样本和复发样本中的DAZAP1表达，结果发现复发MM患者的DAZAP1表达增强(图1G)。同样的，PR亚组是MM中具有高增殖特征的类型，其DAZAP1表达明显高于其他7个亚组(图1H)。以上结果提示DAZAP1表达增加与MM患者预后不良相关。

Figure 1. Elevated DAZAP1 is associated with poor outcome of MM patients. (A) DAZAP1 expression in different stages of MM
from the GSE5900 dataset as shown in the graph. The signal level of DAZAP1 (226620_at signaling) was shown on the y-axis. The groups of
normal plasma (NP, n = 22), monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS, n = 44), and multiple myeloma (MM, n = 351)
were sorted on the x-axis, respectively. (B–F) Kaplan-Meier analysis of overall survival (OS) divided by high and low DAZAP1 expression in
TT2, TT3, APEX, HOVON65 and GSE136337 cohorts. The number of patients in the cohorts was 351, 208, 264, 426 and 288, respectively. (G)
DAZAP1 expression was increased in relapsed patient samples relative to the first diagnosis samples. (H) A box-plot showed DAZAP1
expression in eight MM subgroups.

DAZAP1表达升高促进MM细胞体外增殖

为了进一步探讨DAZAP1在MM细胞增殖中的作用，在CAG和OCI-MY5细胞中，作者利用慢病毒转染对DAZAP1进行过表达，同时，利用小干扰RNA对DAZAP1进行了敲除。转染效率用WB进行了验证 (图2A-B以及补充材料)。CCK8检测结果显示，DAZAP1过表达明显促进了MM细胞的增殖能力，DAZAP1敲除明显抑制了MM细胞的增殖能力 (图2C和2D)。此外，软琼脂集落形成实验发现，DAZAP1过表达细胞具有较强的长期增殖能力(图2E和2F)。综上所述，过表达DAZAP1促进了MM的增殖。

DAZAP1促进MM小鼠中肿瘤的生长

作者进一步体内检测DAZAP1的作用。首先把CAG EV细胞(小鼠左侧)和CAG DAZAP1过表达细胞(小鼠右侧)皮下注射到NOD/SCID小鼠。如图3A-D所示，CAG DAZAP1过表达细胞形成的肿瘤明显大于CAG EV细胞形成的肿瘤。另外，通过对DAZAP1过表达组和EV组肿瘤组织的差异基因的比较，KEGG途径富集分析显示，MAPK信号通路中有较多的基因被富集，提示该信号通路可能参与了DAZAP1对MM细胞增殖的调控(图4A)。有报道称ERK信号通路（是MAPK信号通路中的主要信号通路）在MM细胞增殖中起重要作用。因此，作者想验证DAZAP1是否通过激活ERK信号通路促进MM增殖。因为RAS可调节ERK的磷酸化。因此，作者首先检测了DAZAP1表达对RAS-GTPase活性影响。结果表明，过表达DAZAP1可显著增加RAS-GTPase活性(图4B和补充材料)。此外，WB试验表明过表达DAZAP1会增加了MM细胞中的ERK磷酸化，而敲除DAZAP1则有效地逆转了结果 (图4C-D和补充材料)。以上结果提示，DAZAP1过表达可能通过激活ERK信号通路促进肿瘤的进展。

DAZAP1激活MM细胞中KITLG mRNA的选择性剪接

为了进一步研究DAZAP1在MM中的调控机制，通过rMARTs的AS分析定义了数千个DAZAP1介导的AS事件。图A显示，跳过外显子(SE)是AS事件的主要类型，占AS事件总数的64.6%，其次是alternative 3’splice site (A3SS)和互斥外显子(MXE)，其余类型的AS事件，替代5 '剪接位点(A5SS)和保留内含子(RI)的频率较低，说明DAZAP1主要调控SE。作者进一步确定DAZAP1结合在盒式外显子和3 '剪接位点附近的位置效应通常促进外显子跳跃(图5B)。图5C显示AS的典型结构域。作者将RIP-seq与MM GEP cohorts的分析结合起来，筛选与MM进展相关的DAZAP1调控的AS靶点。根据该策略，选择跳跃第6外显子的KITLG作为下游靶基因去探讨其是否促进 MM进展。KITLG有两个剪接异构体，KITLG isoform2 (NM_000899.5)含有初级蛋白水解裂解位点，KITLG isoform1 (NM_003994.6)缺乏初级蛋白水解裂解位点(5 D)。此外，KITLG的207029_at探针与TT3期MM患者生存率较好相关(图5E)。相反，KITLG的226534_at探针与TT3期MM患者生存率较差相关(图5F)。为了评估可变剪接分析的准确性，作者用PCR方法对MM中KITLG的这两种剪接异构体进行了验证。过表达DAZAP1会导致长转录本的减少 (图5 G)。RIP-qPCR证明DAZAP1直接与内源性KITLG isoform2结合并促进其剪接(图5H)。

Figure 5. DAZAP1 triggers alternative splicing of KITLG mRNA in MM cells. (A) AS events were classified into five categories:
skipped exon (SE), alternative 5′ splice site (A5SS), alternative 3′ splice site (A3SS), mutually exclusive exon (MXE), and retained intron (RI).
(B) Binding of DAZAP1 was close to the 3′ splice site. (C) The typical motif on the peak-bound mRNA regions. (D) Schematic diagrams
showed the alternative splicing of KITLG. (E and F) Two different probes of KITLG corresponded to different patient survivals in TT3 cohort.
(G and H) RNA levels of different isoform of KITLG were tested by PCR and qPCR assays.

KITLG的异常剪接有助于ERK的磷酸化

本研究提出了DAZAP1通过影响KITLG AS事件调节ERK信号通路。为了进一步验证这一假设，作者通过电穿孔使KITLG isoform1和KITLG isoform2转染进入HEK293细胞。用1%琼脂糖凝胶电泳和WB检测转染效率，用WB检测ERK磷酸化水平。结果表明，过表达KITLG isoform1促进ERK的磷酸化而KITLG isoform2过表达抑制磷酸化(图6A-C，补充材料)。同样的结论在MM细胞中得到验证(图6B-D和补充材料)。综上所述，KITLG isoform1 促进MM细胞中的ERK磷酸化。

我们再来简单总结一下作者取得的实验结果：

• 分析MM的临床数据库，发现DAZAP1升高的MM患者生存期较差；
• 发现DAZAP1在体外促进MM细胞增殖，在体内加速MM移植瘤生长；
• KEGG通路富集分析显示，ERK信号通路在DAZAP1-OE MM细胞中被激活；
• 通过RIP-seq和RIP-qPCR分析得到DAZAP1激活KITLG mRNA的选择性剪接；
• DAZAP1通过调节KITLG mRNA的选择性剪接增加ERK磷酸化，促进MM细胞增殖。

综上所述，DAZAP1在MM肿瘤中起促进作用，DAZAP1可能作为MM肿瘤的诊断标记物以及靶向DAZAP1可能成为MM的治疗方法。