• 概论
• 植物组织培养
• 胚胎培养
• 植物愈伤组织的诱导与分化培养
• 体细胞无性系变异与植物改良
• 原生质体培养和体细胞杂交
• 单倍体细胞培养
• 植物遗传转化
• 植物遗传标记与分子标记图谱构建
• 分子标记与辅助选择育种技术

概论

• 生物技术和药用植物生物技术概念

  • 药用植物生物技术：指药用植物基因工程和与之相关的植物组织细胞培养技术、分子标记育种技术等
  • 生物技术：以现代生命科学为基础，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品的一系列技术

• 我国批准的7种具有安全证书的转基因植物和4种进口转基因农产品

  • 截止2013年，发放转基因植物安全证书7种
    • 1997 耐存储番茄、抗虫棉
    • 1999 改变花色矮牵牛、抗病辣椒
    • 2006 抗病番木瓜
    • 2009 转基因抗虫水稻、转植酸酶玉米
  • 进口转基因农产品4种：
    • 转基因棉花(种植)
    • 转基因大豆
    • 转基因玉米
    • 转基因油菜

    除转基因棉花种植外，其余仅限于加工原料

• 1972年，Berg实现了DNA体外重组

• 1993年首例转基因抗病毒烟草进入大田实验

• 第一代转基因作物特征：抗虫、抗除草剂；第二代转基因作物特征：改进品质、增强抗性

• 农业革命：矮化小麦和水稻良种全面推广、杂交水稻成功、药用植物生物技术带来革命。

• 应用：药用植物组织细胞培养、药用转基因作物、分子标记

• 挑战：成果转化、政策层面鼓励、知识产权保护、科学普及和教育

植物组织培养

• 什么是培养基，主要分成哪两类？

  • 培养基：离体培养条件下，针对特定植物组织分化所建立的满足各种组织和器官需要的培养系统。
  • 分类：天然培养基（化学成分不明）、合成培养基

• 列举植物组织培养中的大量元素和微量元素

  • 大量元素（主要元素）：C、H、O、N、P、S、Ca、K、Mg 九种
  • 微量元素（次要元素）：Fe、Mn、Cu、Zn、B、Al 六种

• 植物组织培养的主要是倒置显微镜

• 高压灭菌锅是必备的实验设备

• 根培养基和愈伤组织培养基由植物整体栽培的培养夜发展而来

• MS培养基最常用

• N6培养基是由我国朱至清等学者为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的

• 生长素：用来诱导细胞分裂和根的分化

• 细胞分裂素：促进细胞分裂和愈伤组织形成器官

• 琼脂：一般浓度为0.7%~1.0%

胚胎培养

• 比较胚培养、胚珠培养和胚乳培养三者的异同
  • 植物胚胎培养：指对植物的胚及胚器官进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术，分为成熟胚培养和未成熟胚培养
  • 胚珠培养：指将胚珠从母体植株上分离出来，在无菌条件下，进行离体培养，使其生长发育形成幼苗的技术，分为未受精的胚珠培养和受精的胚珠培养
  • 胚乳培养：指在无菌条件下以胚乳组织为外植体，通过离体培养获得不同倍性的再生植株的技术，分为带胚培养和不带胚培养

种子的结构包括胚、胚乳和种皮三部分，是分别由受精卵（合子）、受精的极核和珠被发育而成。
胚珠发育成为种子，其中受精卵发育成为胚，受精极合发育成为胚乳

• 胚培养应用：获得稀有杂种、获得单倍体、打破种子休眠

• 胚培养的类型：

  • 成熟胚培养：（功能完全）自养期
  • 未成熟胚培养：（依赖周围营养物质）异养期，远缘杂交主要采用 的培养方式

• 胚龄：指从授粉开始到离体时间，胚龄越小，难度越大，成活率越低。

• 培养基成分

  • 氨基酸：谷氨酰胺、水解酪蛋白。
  • 植物浸提物：“胚因子”，椰子汁、水解酪蛋白、干酵母

• 裸子植物中，胚乳由未受精的大孢子发育成的单倍体

• 被子植物中，胚乳由两个极核与一个精核发育成的三倍体

• MS培养基使用频率最高，一般用蔗糖作碳源

• 不同植物愈伤组织的诱导，要求的激素种类和水平不同

• 同时外源性的激素种类和水平还对培养材料的倍性水平有影响

• 胚乳培养的器官分化和植株再生难度远高于对愈伤组织的诱导，且一般有两种途径，即器官发生途径和胚状体发生途径

• 胚乳培养产生愈伤组织多是多种倍性细胞及非整倍体细胞的嵌合体

植物愈伤组织的诱导与分化培养

• 依据Petru，愈伤组织的可以分为哪三个时期，各有什么特点？

  • 启动期又称为诱导期，是愈伤组织形成的起始点
    • 特征：外观无明显变化，但细胞合成代谢活动加强，
  • 分裂期：形成具有分生组织状态细胞的过程
    • 特征：快速分裂，细胞数目增加体积减小，细胞内无大液泡，细胞核大，核仁明显
  • 形成期，形成具有无序结构的愈伤组织时期
    • 特征：表层分裂减慢和停止，内部细胞开始分裂

• 脱/去分化：指使已分化的植物细胞回复到未分化的分生状态并可表达细胞全能性的过程

• 再分化：处于脱分化状态的愈伤组织或细胞，可以再度分化成不同类型的细胞、组织和器官，甚至最终再生成完整植株的过程。

• 愈伤组织：将植物体的某个部分切下，用作外植体，接种到适宜的培养基上培养，外植体组织增生而产生的一团脱分化的细胞组织

• 继代培养：愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基以保证培养物的正常生长的过程。代愈伤组织长到2~3 cm或时间到4~6周需继代一次

• 褐化：指若长时间不继代培养，因代谢产物积累而产生毒害作用，使愈伤组织变成黑褐色的现象。

• 悬浮培养：是将游离的细胞或小的细胞团置于液体培养基中进行培养和生长的一种技术。一般是将生长旺盛的小块愈伤组织放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤组织块变成具有良好分散性的细胞和小的细胞聚集体

• 诱导愈伤组织的关键是培养条件，其中主要是激素成分和浓度，特别是生长素

• 选择易于分散的细胞类型，一般选用很疏松的愈伤组织材料进行培养

• 培养基组成影响细胞的分散程度，特别是植物激素

• 根据是否需要更换培养液，悬浮细胞继代培养可分为成批培养和连续培养

• 植物组织细胞离体培养形成再生植株有两种途径：器官再生和体细胞胚胎发生

• 组培中最常见的分化器官是芽和根

• 芽原基一般起源于组织表层的薄壁组织细胞，属于外起源；
  根原基发生与组织的深处，是内起源的

• 体细胞胚形成以间接途径为主

• 胚状体具有两极性

• 基因型的差异决定体细胞胚发生能力，包括不同种、同种的不同品种、甚至同品种的不同地理来源。

体细胞无性系变异与植物改良

• 简述体细胞无性系变异的细胞学和分子遗传学基础

  • 细胞学遗传基础：
    • 外植体细胞先存的变异，染色体多倍化现象
    • 染色体数量变异： 再生植株染色体数量变异被认为是无性系变异的最主要证据和来源，尤其以非整倍体发生频率最高
    • 染色体结构变异：无性变异系中最有应用前景的一种，是产生体细胞变异的主要机制，也是最难阐明的一种变异类型
  • 分子遗传学基础：
    • 基因突变：在愈伤组织脱分化、再分化中，常引起单基因突变
    • 碱基修饰：基因组中碱基会发生某种化学修饰，最常见为DNA的甲基化。
    • 基因重排：在细胞脱分化时期 ，DNA分子内部核苷酸顺序的重新排列
    • DNA总量变化：通过基因扩增和基因丢失实现的
    • 专座因子激活：

• 体细胞无性系变异：指源于外植体的、经组织或细胞脱分化和再分化培养过程而在再生植株中表现的变异，具有广泛性和普遍性

• 依据变异来源进行分类：

  • 自发型变异：嵌合体是自发变异的重要来源。
  • 诱导型变异：化学诱变较物理诱变较好

• 依据变异能否遗传进行分类：

  • 外遗传变异：外部影响，不能遗传
  • 可遗传变异：稳定保持的遗传

原生质体培养和体细胞杂交

• 原生质体的培养方法及常用培养基有哪些

  • 液体浅层培养：是目前较常用的培养方法，适用于容易分裂的原生质体
  • 固体培养： 也称为琼脂糖平板法或包埋培养法，悬浮后添加凝固剂，凝固后封口培养。
  • 固液双层培养法：结合上面二者优点，培养皿底部先铺一层固体培养基，待凝固后在其上进行液体浅层培养。
  • 培养基包括：MS培养基、B5培养基、KM8p培养基

• 什么是原生质体融合，融合的方法有哪些

  • 原生质体融合也称为细胞融合、体细胞杂交、超性杂交或超性融合，指不同来源的原生质体自发或在人工条件下融合为一个杂种细胞的过程或方法
  • 自发融合
  • 化学融合
  • 电场诱导法
  • 激光诱导法
  • 基于微流控芯片的细胞融合技术

• 原生质体：指采用机械或酶解法去掉了细胞壁的裸露细胞

• 对称融合：指融合时双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息，多形成对称杂种。

• 非对称融合：指一方亲本（受体）的全部原生质与另一方亲本（供体）的部分核物质或胞质物质重组，产生不对称杂种，及**“供体-受体”**系统。

• 克服传统育种方法所面临的生殖障碍

• 原生质体培养能够产生体细胞无性系变异

• 原生质体分离方法较多，目前使用最广泛的为酶解法

• 原生质体培养中的粘连现象：对原生质体有促进或抑制作用，粘连的发生主要是由于原生质体表现产生电荷

单倍体细胞培养

• 离体小孢子的发育途径有哪些

  • 花粉不均等分裂途径：小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成一个较小生殖细胞和一个较大的营养细胞。进行第二次有丝分裂时，由于环境改变，这时分裂增殖方式有4种，最后形成二倍体或多倍体植株。
  • 花粉均等分裂途径：均等的子核各自分裂，最后形成单倍体植株；均等子核发生核融合，最后形成多倍体胚。

• 单倍体：指具有配子染色体数的个体或组织。

• 单倍体可自发产生，也可诱发产生

• 单倍体的遗传行为：具有一定同源关系的染色体可以部分配对，从而可以对染色体体演化过程进行研究

• 花粉单倍体是纯合配子体

• 甘蓝型油菜中最为普遍，32°诱导孤雄生殖

植物遗传转化

• 植物基因克隆的主要载体有哪些

  • 质粒载体
  • 噬菌体载体
  • 人工染色体载体

• 植物基因克隆：通过一定的分子生物学手段，将植物基因组中编码基因的DNA分子或者cDNA分离出来，在此基础上进一步对其基因的结构与表达、编码蛋白定位以及生理生化功能等诸多方面进行研究，从而获得有关该基因的全面信息。

• 依据基因表达产物可以把基因分为三大类：

  • 不转录也不翻译，如调控序列
  • 只转录但不翻译，如tRNA、rRNA、microRNA等
  • 既转录又翻译，如各种编码基因

• 基因工程载体通常具有以下结构特征：

  • 具有外源重组基因插入的多克隆位点
  • 具有能够在宿主细胞中进行复制的有关元件
  • 具有可筛选或鉴定的选择标记
  • 通常对受体细胞不具有毒性，同时对环境不存在显著的影响

• 农杆菌介导的遗传转化已成为植物基因工程应用最为普遍的转化策略。目前主要有根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒两种。

• 目前使用最广泛的转基因方法为根癌农杆菌介导和基因枪介导的两种

• 农杆菌菌株高侵染活力的生长时期，选择对数生长期的菌株

• 基因活化的诱导物，最常用的诱导物是乙酰丁香酮

• 替代性转化法，导入并表达于生活在植物体内的内生真菌
  法

• 修饰过的成物体称之为GMO（Genetically modified organism），主要包括转基因植物、转基因动物和转基因微生物三大类

• 植物总DNA提取方法：CTAB和SDS法

• Northern为RNA*DNA杂交

• Western杂交：原理为抗原抗体特异性结合

植物遗传标记与分子标记图谱构建

• 遗传标记的种类都有哪些
  • 形态标记：指肉眼可见的一类外观形态特征
  • 细胞学标记：指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。
  • 生化标记：指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统，主要包括储藏蛋白、同工酶等标记。
  • DNA分子标记：指DNA水平上的遗传多态性，简称为分子标记
• 比较主要DNA标记的异同
  • RFPL
  • RAPD Random Amplified Polymorphism DNA
  • SSR simple sequence repeat
  • AFLP mplified fragment length polymorphism

• 遗传标记：指能稳定遗传的、易于识别的、特殊的遗传多态性形式
• 遗传多态性：经典遗传学中指等位基因的变（差）异；而现代遗传学中，指基因组中任何座位上的相对差异或DNA序列的差异
• 大多数农艺性状均表现为数量性状的遗传特点
• RFLP标记具有共显性、重复性和稳定性好等特点
• PCR技术可以极大地降低对样品数量和质量的要求

分子标记与辅助选择育种技术

• 简述传统育种与分子标记辅助选择育种的差异

  • 传统育种：对目标性状的表现型直接进行评价和选择，或通过与目标性状连锁的形态学标记进行选择，适宜于简单的质量性状，而对复杂的数量性状效率不高
  • 分子标记辅助选择：利用分子标记技术，检测与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型，推测和获知目标基因型，直接对目标基因进行选择。相较于传统育种，可以大大提高效率。

• 何为前景选择与背景选择，二者有何关系

  • 前景选择：对目标基因进行选择。取决于分子标记与目标基因间连锁的紧密程度。连锁越紧密，选择的准确率越高，所要求选择的个体数越少。前景选择的作用：保证所选后代中均携带有目标基因
  • 背景选择：为了加快育种进程，开展前景选择的同时，还要开展背景选择，即除目标基因外的整个基因组的选择。
  • 关系：不同于前景选择，背景选择的对象几乎包含整个基因组，也就要求选择标记能够覆盖整个基因组。在标记辅助选择育种中，由于目标基因是选择的首要对象，故一般先进行前景选择，以保证不丢失目标基因；然后对选中的个体进行背景选择。

• 基因转移：又称基因渗入，指将供体亲本中的优良基因渗入到受体亲本遗传背景中，从而达到改良受体亲本个别性状的目的。

• 分子标记辅助选择是依据标记基因型推断目标性状基因存在与否，从而选择携带目标基因的个体。

• 作物育种的目标性状多为数量性状

• 育种过程采用分子标记技术与回交育种相结合的方法，可以快速将与分子标记连锁的基因转移到另一个品种，这一过程可同时进行前景选择和背景选

• 目前基因定位研究与育种应用脱节是限制分子标记辅助选择技术应用到育种中的一个主要原因。