• 一、基因工程基本概念
• 二、基因工程发展历史
• 三、预习
• 四 、第三章 分子克隆载体
• 五、预习
• 六、预习
• 七、第五章
• 八、第五章 核酸凝胶电泳2
• 九、第六章 基因芯片技术
• 十、基因工程 Gene Engineering

一、基因工程基本概念

1. 视频中提到“蓝色妖姬”是什么？
将三色紫罗兰的一种能够刺激蓝色素产生基因导入玫瑰使其花瓣能够自然产生蓝色，由此得名蓝色玫瑰。

2. 基因工程三大要素是什么？
供体、受体、载体

3. 基因工程上游和下游技术包括哪些？

• 上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建。
• 下有技术：工程菌和细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化。

4. 用哪六个字可以概括基因工程基本流程？
切、接、转、增、检、表

• 分离含有目的基因的片段。
• 在体外将目的基因片段连接到载体。
• 转入受体细胞。
• 筛选阳性克隆。
• 从阳性克隆中提取而后鉴定目的基因。
• 将目的基因转入到表达载体基因上，导入宿主细胞，实现功能表达。

5. 基因工程的意义有哪3个方面？

• 利用细菌的表达调控机制超量合成其它生物体内含量极微却具有高附加值的生理活性物质。
• 设计构建新物种
• 搜寻、分离与鉴定生物体内的有用遗传信息资源。

6. 基因工程的理论依据有哪些？

• 不同的基因具有相同的物质基础。
• 基因是可以切割的。
• 基因是可以转移的。
• 多肽与基因间存在对应关系。
• 遗传密码是通用的。
• 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。

二、基因工程发展历史

1. 基因工程发展历程大概分为几个阶段？

• 准备阶段：1866，G.Mendel分离与自由组合定律，阐明遗传因子决定生物性状；1909,丹麦生物学家W.Johannsen提出gene；1910，T.H.Morgan遗传物质存在于染色体，基因的连锁和互换定律，基因论；1944,美国微生物学家Avery，细菌转化研究，证明基因是载体，染色体遗传学阶段；1953，Watson-Crick,DNA双螺旋结构；1958，F.Crick，中心法则；1966,64种遗传密码子被破译
• 问世阶段
• 成熟与腾飞阶段

2. 视频中提到基因工程的理论基础和技术基础分别是什么？

• 理论基础
  • DNA是遗传物质
  • DNA分子的双螺旋结构和半保留复制
  • 遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式
• 技术基础
  • 限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割
  • DNA连接酶的发现与DNA片段的连接
  • 基因工程载体的构建与应用

3. 基因工程的诞生元年是哪一年？

• 1973年被定位基因工程的诞生元年

4. 第一例转基因动物、植物分别是什么？

• 第一例转基因动物，转基因小鼠
• 第一例转基因植物，转基因烟草

5. 哪一年美国提出人类基因组计划？

• 1991美国提出人类基因组计划并实施

三、预习

1. 简述蓝白斑筛选原理及实验操作技

• 野生型埃希氏大肠菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。

2. 质粒载体的基本特性包括哪几方面

• 质粒的分子大小：1~200kb
• 质粒能自我复制，是独立的复制子
• 质粒不亲和性，
• 质粒具有转移性，许多质粒可以通过细菌结合的作用转移到新的宿细胞中
• 具有复制起点
• 具有抗生素抗性基因
• 若干个限制性内切酶的的单一位点
• 具有较小的分子量和较高的拷贝数

四 、第三章 分子克隆载体

1. 名词解释

• 载体：将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具
• 质粒：质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并稳定遗传的一类核酸分子

2. 简答题
2.1 载体应具备的条件。

• 在受体细胞中能保存下来并能大量复制
• 有一个至多个限制酶切点
• 有一定的标记基因，便于进行筛选
• 对受体细胞无害

2.2 简述质粒载体构建的主要内容。

• 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

五、预习

1. 病毒载体的类型有哪些？请分别说

• 单链噬菌体载体
  • 具有+DNA链
  • 复制型是双链环状DNA
  • RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌
  • 不存在包装的限制
  • 可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于用作探针或测序
• 双链噬菌体载体
  • 长度为48502bp
  • 双链线性DNA
  • 两端有cos位点可以环化

六、预习

1. 视频中提到的主要核酸提取技术流程是什么？

• 材料准备
• 破碎细胞或包膜——内容物释放
• 核酸分离
• 沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
• 核酸溶解在适量的缓冲液中

2. 核酸检测内容包括哪些？怎样检测？

• 紫外吸收法：核酸在260nm左右有最大的吸收峰
  • 分光光度计先用一定量的水校正
  • 吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加入到盛有一定体积水的石英比色杯
  • 测定待测样品在230nm、260nm、280nm的OD值
  • 计算浓度
• 核酸的凝胶电泳（荧光光度法）：DNA、RNA在荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面之后，DNA、RNA样品在紫外光的激发下，可发出红色荧光，荧光强度与和核酸含量成正比。使用一系列的不同浓度DNA溶液作为标准对照，可以被测DNA溶液浓度

七、第五章

1. 核酸提取总原则有哪些？

• 保证核酸一级结构的完整性
• 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度
• 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子
• 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除

2. DNA鉴定内容包括哪些？

• 浓度鉴定
• 纯度鉴定
• 完整性鉴定

3. 简述溴化乙锭在核酸检测中的作用原理。

• 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析

4. 简述无水乙醇沉淀DNA的基本原理。

• 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。

5. 简述碱裂解法提取质粒DNA的基本原理。

• 在NaOH存在的强碱性（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA，细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中

八、第五章 核酸凝胶电泳2

1. 简述用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同产地桔梗基因组DNA的技术流程。

2. 试述琼脂糖凝胶电泳的基本原理及应用。

• 原理：琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
• 应用：但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

3. 脉冲场凝胶电泳的影响因素及操作要点有哪些？

• 脉冲时间：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。
• 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。
• 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200，研究证实900夹角也非常有效。
• 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。

九、第六章 基因芯片技术

1. 名词解释：

• 生物芯片：主要指通过平面细微加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大量信息的检测
• DNA芯片：就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息
• 蛋白质芯片：就是选择一种能够固定地结合蛋白质分子的固体载体，在上面按预先设计的方式固定大量蛋白质，形成蛋白质的微阵列，然后加入与之特异性结合的带有特殊标记的蛋白质分子，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检

2. 简述基因芯片的工作原理及制备基本步骤。

• 工作原理：基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析
• 制备的基本步骤：芯片制作、样品制备、分子杂交、信号检测与结果分析

3. 查资料试述后基因组时代。

• 后基因组学(post genomics)，又称为功能基因组学(functional genomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和利用新的实验手段，通过在基因组和系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。

十、基因工程 Gene Engineering

1. 文献阅读：

• PCR反应中引物的使用与保存
• 黄芩DNA指纹分析及质量相关研究

2. 分别简述巢式PCR、梯度PCR、免疫PCR反应的原理、技术及应用。

• 巢式PCR：
  • 原理：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
  • 应用：一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等
• 梯度PCR
  • 原理：梯度PCR其实就是将多个的PCR反应放在一起做，不用一次一次的作很多次，温度梯度PCR可以很快的找出最适合的退火温度，或者说可以在最适合的退火温度下扩增出目的条带 。
  • 应用：以检测DNA/RNA为目的的各种病原体检测及基因分析
• 免疫PCR
  • 原理：免疫PCR (Immuno PCR, Im-PCR) 是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。
  • 应用：被广泛用于临床及生物学、医学研究