Single-cell transcriptomics identifies divergent developmental lineage trajectories during human pituitary development
单细胞RNA测序解决了人类胚胎(embryo)胸腺前淋巴祖细胞(Pre-thymic Lymphoid Progenitors)和胸腺器官(Thymus Organogenesis)发生的时空(Spatiotemporal)发育问题

显示本研究总体策略的方案。来自AGM区域、肝脏、血液以及处于指定发育阶段的人类胚胎和胎儿胸腺原基的细胞被分类，并进行droplet-based 10x Genomics或well-based modified STRT-Seq。对数据进行分析，以证明cell clusters、DEG、发育轨迹和潜在的配体-受体相互作用。还进行了ETPs的Lineage-potential assay of和免疫染色，以验证预测的配体-受体相互作用。

UMAP显示的胸腺原基(thymic primordia)中细胞特性的Cell clusters。颜色表示细胞类型。每个点代表一个细胞。

在UMAP上可视化marker基因的表达，以鉴定细胞类型

热图显示人类胚胎(human embryonic)和胎儿胸腺(fetal thymus)中造血细胞(hematopoietic cells)、内皮细胞(endothelial cells)、上皮细胞(epithelial cells,)和间充质细胞(mesenchymal cells)簇中的DEG块（前20个基因）。

通过t-SNE，可视化人类胸腺原基中造血细胞(hematopoietic cells)亚群细胞类型（左），和发育阶段

小提琴图显示每个细胞群中的特征基因表达。颜色代表不同细胞类型

热图显示人类胸腺原基中10个造血细胞亚群的DEG块

热图显示了在in embryonic ETP and fetal ETP1 and fetal ETP2中，表面标记(D)和转录因子(E)的表达。

OP9-DL4 和 MS-5 共培养实验表明，Lin - CD45 + CD34 + CD1a - CD7 +细胞具有 T、B、NK 和骨髓谱系潜能。

图 2 A中描述的胚胎 ETP、胎儿 ETP1 和胎儿 ETP2 的细胞周期分析。颜色代表细胞身份。点、正方形和三角形分别代表细胞周期的 G0/G1、S 和 G2/M 阶段。

在所有测试的发育阶段，造血细胞超群中每个亚群的比例。颜色代表图2A 中描述的细胞簇。对于第 8 周、第 9 周和第 10 周的胎儿胸腺样本，进行的独立实验数量为 1。共培养实验，使用胎儿胸腺样本代表 n = 2 个生物重复和 2 个在第 9 周独立的实验。

在多个发育阶段，来自不同造血和造血部位的 ETP 和淋巴祖细胞之间的 Spearman 相关矩阵热图。

基于位点（左）和发育阶段（右）的 ETP 在 AGM 区域、肝脏和血液中汇集淋巴祖细胞的细胞簇的可视化。

用 ETP 可视化 AGM 区域、肝脏和血液中汇集的淋巴祖细胞的细胞簇（仅突出显示 ETP），显示 ETP 的簇（左）和发育阶段（右）。

在主成分分析（PCA）图（左）上预测集合淋巴祖细胞（灰色）和ETPs的细胞周期状态，显示具有不同细胞周期状态的两组ETPs（TSP样ETPs和增殖性ETPs）（右）

点图显示了在TSP样ETPs和增殖性ETPs中DEGs（前20位）（左）、TFs（中）和表面标记物（右）的比例表达水平。颜色代表比例表达，大小编码基因表达细胞的比例。

对来自胎肝（CS 20和CS 23）和ETPs的淋巴前体进行拟时间分析，通过Monocle2用indicated基因的表达（下图）表面发育轨迹（上图）。独立实验数量为1对来自CS 14和CS 15的AGM区域样本；来自CS 15和CS 17的血样；来自CS 15、CS 17、CS 20和CS 23的胎儿肝脏样本（第8周）；以及第8周、第9周和第10周的胎儿胸腺样本；

通过基于细胞身份的UMAP分析，可视化来自AGM区域（CS 14和CS 15）、肝脏（CS 15和CS 17）、血液（CS 15和CS 17）、图3F中确定的TSP和胸腺ETP（胚胎ETP和胎儿ETP1）的集合淋巴祖细胞的细胞簇。这些颜色表示淋巴祖细胞的起源（上图）和发育阶段（下图）。

B UMAP可视化显示指定基因的表达。C 以及淋巴祖细胞的动力学(绿色椭圆形部分)。

对于来自AGM区域、血液、胚胎和胎儿肝脏（CS 15和CS 17、CS 20和CS 23）和胸腺（ETPs）IL7R表达簇中，前10位DEG（左）、TFs（中）和表面标记编码基因（右）的热图。

Monocle2 的 Pseudotime 分析揭示了 γδ 和 αβ T 淋巴细胞规范轨迹。

TCR 基因（TRDC、TRGC2、TRBC2和TRAC）沿 γδ 和 αβ T 细胞规范过程的差异表达。

Monocle2 中的 BEAM 分析表明随着 ETP 发展到 γδ 或 αβ T 命运的不同表达模式。

从 ETP 到 γδ 或 αβ T 前体的规范过程中每个模块的代表性基因的表达。

热图表明表面标记编码基因在从 ETP 到 γδ 或 αβ T 前体的发育过程中的差异表达。

各模式转录因子的相关网络。每个集群中排名前35位的TF用于构建网络；显示了具有3条以上边的节点（TF）。对第8周、第9周和第10周的胎儿胸腺样本进行的独立实验数量为1。

A 通过细胞身份对TEC簇进行UMAP可视化，表明在测试的所有发育阶段有三个细胞簇。UMAP可视化（B）和条形图（C）显示了测试发育阶段每个细胞簇的比例。

显示每个 TEC 簇的第三个 PP、cTEC 和 mTEC 特征的策划基因表达的 UMAP 可视化。

热图显示了在不同 TEC 簇中表达的不同基因块。

CD74和HLA-DRA的表达，TEC 成熟的代表基因（左），以及与CD74具有最大 Pearson 相关性的前 30 个基因，按 p 值排序（右）。

GSEA 表明不同的信号通路和生物过程在 TEC2 和 TEC3 中的富集程度不同。对于第 8 周早期 (CS 20)、第 8 周晚期 (CS 23)、第 9 周和第 10 周的胎儿胸腺样本，进行的独立实验 (STRT-seq) 的数量为 1。

示意图显示了造血细胞和基质细胞（内皮细胞、上皮细胞和间充质细胞）之间的配体-受体相互作用。

配体-受体相互作用网络显示基质细胞 (TECs、内皮细胞和间充质细胞) 和造血细胞之间的潜在通信。每个点代表一个簇（细胞类型），每个边缘代表相互作用，边缘的颜色编码配体-受体对的数量。

热图显示胸腺细胞与 TEC（TEC1、TEC2 和 TEC3）、内皮细胞和间充质细胞簇之间的主要配体-受体相互作用。颜色代表配体-受体相互作用的强度。

指定配对的配体及其受体基因的表达。箱线图显示了每个指定配对的胎儿 ETP1 和基质细胞（TEC 和间充质）中配体和受体基因的 log2 标准化表达。注意：胎儿 ETP1 中基因的对数标准化表达是向上的，基质细胞中配体基因的表达是向下的，以 0 为界。

免疫荧光染色表明 IGF1R 对 T 淋巴细胞祖细胞 (CD45 + CD34 + ) 和第 10 周胎儿胸腺原基中周围间充质细胞 (CD140a + ) 产生的 IGF2 的相互作用。比例尺，100 μm。黄色箭头指向 IGF1R，白色箭头指向 IGF2。对于 10x Genomics，第 8 周、第 9 周和第 10 周的胎儿胸腺样本进行了 1 次独立实验，免疫荧光染色从第 10 周开始进行了 1 次胎儿胸腺样本。